СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ B-КЛЕТОЧНОГО ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОГО ФАКТОРА Советский патент 1995 года по МПК G01N33/535 

Описание патента на изобретение SU1614659A1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для исследования биологических материалов в лабораторно-клинической практике.

Цель изобретения упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом. Из периферической крови больных В-ХЛЛ 3 и 2, осложненной анемическим синдромом, стадиями выделяют мононуклеары (МК) центрифугированием гепаринизированной венозной крови (5 мл, содержащей 500 ЕД гепарина) в градиенте плотности фиколлаверографина (3 мл, плотность 1077). Выделение сепарированных В-лимфоцитов проводят на 20 мл колонках с нейлоновым волокном (0,1 г волокна на 1 мл объема колонки).

Полученные В-лимфоциты (1х105 лунку) культивируют в круглодонных лунках планшетов для иммунологических исследований в среде RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл 1-глютамина, 2 мМ HEPES-буфером, 100 мкг/мл гентамицином и 10% фетальной телячьей сыворотки теленка (FCS, FLow) при 37оС и СО2-инкубаторе. В качестве источника В-клеточного дифференцировочного фактора можно использовать супернатанты МК здоровых доноров, полученные путем инкубации лимфоцитов в течение 48 ч с ФГА в дозе 1:1000 в аналогичной культуральной среде. Фетальная телячья сыворотка в последнем случае составляет 1% Указанный супернатант (СФГА) добавляют в культуры В-клеток в концентрации 33%
Секрецию иммуноглобулинов оценивают иммуноферментным методом. Для этого 96-луночные, плоскодонные планшеты (FLow) обрабатывают раствором бараньих антител против IgM человека (10 мкг/мл) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) в объеме 0,1 мл/лунку в течение 4-5 ч при 37оС во влажной атмосфере. Далее планшеты троекратно отмывают от несвязавших с пластиком анти-Ig антител фосфатзабуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2). Для предотвращения неспецифического связывания планшеты обрабатывают блокирующим раствором (1% -ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БCA, Sigma) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) объеме 0,2 мл/лунку в течение 16-18 ч при 4оС во влажной камере. После этого планшеты троекратно отмывают раствором 0,05% твина (Твин 20). Исследуемые культуральные супернатанты разводят 1: 4 забуференным физиологическом раствором, содержащим 0,05% Твин 20, перед внесением в лунки планшетов для иммуноферментного анализа. Одновременно готовят калибровочные разведения эталонной сыворотки человека (от 1600 нг/мл до 12,5 нг/мл для иммуноглобулинов класса М) в аналогичном растворе. Супернатанты и эталонную сыворотку вносят в объеме 0,1 мл/лунку и инкубируют 1-2 ч при 37оС. Планшеты отмывают 5 раз 0,05%-ным раствором Твин 20. В лунки вносят конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против IgM человека (0,1 мл/лунку) в разведении 1:1000. Инкубацию проводят при 37оС в течение 1-2 ч. Планшеты отмывают 10 раз 0,05% Твин 20. Ферментативную активность пероксидазы в образовавшихся комплексах определяют добавлением в лунки по 0,1 мл субстратного раствора, приготовленного следующим образом: 1,2 фенилдиамин (10 мг на 1 мл метилового спирта) разводят в 0,05 М цитратном буфере (рН 4,6) в пропорции 1:99 и к 100 мл указанной смеси добавляют 0,01 мл 33%-ного раствора перекиси водорода. После инкубации в течение 10-15 мин при комнатной температуре останавливают цветовую реакцию добавлением в лунки по 0,05 мл 50% серной кислоты. Фотометрию проводят на аппарате Титертек Мультискан (FLow) при длине волны 472 нм.

Об активности дифференцировочного фактора судят по индексу влияния (ИВСФГА), рассчитанному по формуле
Пределы числовых значений параметров определяются точностью аппаратуры, пригодной для медицинских целей.

П р и м е р. Сравнение активности В-КДФ в супернатантах ФГА-стимулированных МК двух здоровых доноров. В качестве тест-системы использованы В-клетки больного А. 56 лет с диагнозом ХЛЛ, 3 стадия, гепатоспленомагалический синдром, осложненный анемическим и тромбоцитопеническим синдромами, прогрессирующее течение. Клинически у больного были обнаружены увеличенные лимфоузлы (до 3 см), пальпировалась увеличенная печень (на 3 см ниже края реберной дуги). Анализ крови показал наличие анемии (эритроциты 2,9 х 1012/л), лейкоцитоз (35 40х109/л) с выраженным лимфоцитозом (94% лимфоцитов).

В присутствии СФГА донора 1 ИВ-3,8, что свидетельствует о наличии активности В-КДФ в указанном супернатанте.

При оценке активности В-КДФ в СФГА донора 2 активность дифференцировочного фактора не выявляется (ИВ=0,8).

Способ упрощает получение тест-системы, а также позволяет повысить чувствительность способа путем замены метода бляшкообразования на иммуноферментный анализ.

Похожие патенты SU1614659A1

название год авторы номер документа
Способ определения иммунопатологического состояния организма, связанного с нарушением В-клеточного звена иммунитета 1988
  • Останин Александр Анатольевич
  • Черных Елена Рэмовна
  • Некипелова Валентина Ивановна
  • Шубинский Георгий Зиновьевич
SU1686365A1
СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 1995
  • Миронов Владимир Флорович
  • Чернышев Евгений Андреевич
  • Малочкин Виктор Васильевич
  • Мартынов Александр Игорьевич
  • Куликов Геннадий Алексеевич
RU2108096C1
Штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-Ba-LF-продуцент человеческих моноклональных антител против летального фактора возбудителя сибирской язвы 2018
  • Рябко Алена Константиновна
  • Марьин Максим Александрович
  • Карцева Алена Сергеевна
  • Зенинская Наталья Алексеевна
  • Силкина Марина Владимировна
  • Мунтян Яна Олеговна
  • Фирстова Виктория Валерьевна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2699193C1
СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕННОГО ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО 1998
  • Чернова О.В.
  • Колядко Т.М.
  • Штарк М.Б.
  • Эпштейн О.И.
RU2168335C2
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А 1992
  • Василенко Н.Ф.
  • Ефременко В.И.
  • Гнутов И.Н.
RU2065164C1
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТИРОКСИНУ 1993
  • Данилова Н.П.
  • Василов Р.Г.
  • Крупина Н.В.
RU2049816C1
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ "ЛИМФОКИНИН", ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ 1993
  • Быковская С.Н.
  • Шадрин О.В.
  • Дворянченко Д.Ю.
RU2048816C1
Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вирусной инфекции у детей 1990
  • Попова Изольда Александровна
  • Гользанд Ирена Викторовна
  • Попов Борис Валентинович
SU1802329A1
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО ПЕРИОДА ПОЛИТРАВМЫ ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА 1995
  • Гонтарь И.П.(Ru)
  • Корж Николай Алексеевич
  • Грошев Ю.В.(Ru)
RU2151398C1
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К JGG ЧЕЛОВЕКА 1992
  • Ефетов К.А.
  • Тэтин С.Ю.
  • Князева О.А.
RU2008350C1

Реферат патента 1995 года СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ B-КЛЕТОЧНОГО ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОГО ФАКТОРА

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для исследования биологических материалов в лабораторно-клинической практике. Цель изобретения упрощение способа. Для этого в качестве тест-системы для оценки активности В-клеточного дифференцировочного фактора используются В-клетки больных в 3- и 2-й стадиях, осложненных анемическим синдромом хронического лимфолейкоза. Об активности фактора судят по усилению секции иммуноглобулинов с помощью иммуноферментного анализа.

Формула изобретения SU 1 614 659 A1

СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ B-КЛЕТОЧНОГО ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОГО ФАКТОРА путем измерения показателей интенсивности дифференцировки B-лимфоцитов в тест-системе, с последующей оценкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве тест-системы используют культуру клеток B-лимфоцитов больных B-клеточным вариантом хронического лимфолейкоза в 3 и 2 стадиях, осложненных анемическим синдромом, а интенсивность дифференцировки оценивают по количеству секретируемых иммуноглобулинов методом иммуноферментного анализа.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1995 года SU1614659A1

Okada M., Sakaguchi N., Yshimura N
et al
B
cell grouth Factor and B cell differentiation Factor From human T hibridomas
Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба 1920
  • Богач Б.И.
SU11A1
exp
Гребенчатая передача 1916
  • Михайлов Г.М.
SU1983A1
Соломорезка 1918
  • Ногин В.Ф.
SU157A1
Автоматический аппарат для тушения пожаров 1912
  • Фальковский Ф.Н.
SU583A1

SU 1 614 659 A1

Авторы

Черных Е.Р.

Останин А.А.

Шубинский Г.З.

Курманова Л.В.

Ермолин Г.А.

Даты

1995-10-27Публикация

1987-12-22Подача