Способ диагностики ревматизма Советский патент 1992 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическим способам диагностики ревматизма.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа диагностики ревматизма.

Способ осуществляется .следующим образом.

Кровь для исследования получают венепункцией кубиталыюй вены в количестве 20,0 ил. В качестве антикоагулянта используют гепарин Рихтер - 300 ME. Кровь разводят средой 199 в соотношении I :,6. Разведенную кропь осторожно наслаивают пастеровской пипеткой на 3,0 нл фнкол„т-перогрл:Ьнко вого градиента плотностью 1,078, центрифугируют 25 мин при 1500 об.. мин (350 g). Пастеровской пипеткой с тонким концом отсасывают беловатое облачко лимфоцитов в пробирку со средой 199, тщательно ресуспендируют и отмывают средой 199 путем центрифугирования при 1500 об/мин (350 g) и течение 9 мин. Далее разделяют клетки в колонках с нейлоновой ватой с предварительной подготовкой среды и колонок для разделения лимЛоцитов. К 50,0 мл среды 199 прибавляют 2,0 мл. инактивированной эмбриональной теля- чей сыворотки, перемешивают во флаконе стеклянной палочкой и помещают в термостат при 37°С. В чашке Петри одноразовыми иглами волокнят 50 мг немлоновом ваты для вмдел-.мшя Ь-кле- ток. Колонку на 2/3 рыхло заполняют нейлоновой ватой и промывают 150,0 мл .физиологического раствора, затеи

О СЛ

Ј

ГчЭ

дои средой 199. Промытую колонку помещают в горизонтальном положении в увлажненной чашке Петри в термостат

г. О

закапывают по 0,005 мл нейтрального формалина для фиксации реакции. Учет реакции проводят на инвертированном

при температуре 37,4°С. Лимфоциты, микроскопе МБИ-14 и выражают в промытые средой 199, разводят в 1,0 мл нагретой до 37,4°С среды (199 + ЭТС). Суспензию лимфоцитов по каплям прибав- - ляют в колонку, которую непосредствен- но перед введением клеток промывают jg ,2,0 мл теплой среды (119 + ЭТС). Ко- ,;лонку помещают в термостат на увлажненной чашке Петри на 30 мин при 37,4°С. После инкубирования ставят ко- 1лонку вертикально и промывают последе 15 вательно над 6 пробирками, прокапывают через колонку над каждой пробиркой около 8,0 мл среды (199 + Э1С). При промывании колонки над пробирками 1 и 2 производят энергичное встряхи- 20 ,вание, а начиная с пробирки 3 - осторожные возвратно-поступательные дви- ,жения, не касаясь верхнего слоя ваты. jНад пробирками 5 и 6 выдавливают всю (жидкость из колонки, отжимая вату. 25 В пробирках 5 и 6 собираются В-клетки. Лимфоциты из пробирок 5 и 6 отмывают 2 раза путем центрифугирования при 1500 об/мин (350 g) в точение 10 мин, затем тщательно ресуспендируют, дово- JQ дя до концентрации 1,5x10 клеток . в 1,0 мл, и используют для постановки микролнмфоцитотоксического теста. В микрокамеру под вазелиновое масло, которое используется в количестве 35 0,005 мл в каждоi тестовой, лунке в качестве покрытия для предотвращения испарения небольшого количества реагентов, последовательно раскапывают

центах. Подсчитывают число погибших клеток на 100 клеток в каждой лунке Разница между процентом погибших кл ток на 100 клеток- в каждой лунке. Разница между процентом погибших кл ток в контроле и опыте является результатом теста и отражает процент В-клеток, прореагировавших с монокл нальными антителами Д8/17. Положительным считают результат более 10%

П р HNM е р 1. Больной Е., 21 год Заболел в ноябре 1988 года через 2 недели после ангины, когда появились боли и припухлость в крупных суставах. В апреле 1989 года на фон мигрирующего артрита стал отмечать боли в области сердца и сердцебиени в связи с чем был госпитализирован. После полного клинико-лабораторного обследования был поставлен диагноз: ревматизм в активной Лазе. Первичны ревмокардит. Формирующийся митральн порок сердца. Н-0.

Для выявления генетического марк ра ревматизма -аллоантигена В-лимфо цитов Д8/17, был применен предлагае мый метод. Выделенные В-клетки внос ли в тестовые лунки микрокамеры в к личестве 0,001 мл в каждую; в опытн лунки были предварительно закапаны моноклопальные антитела Д8/17 в кол честве 0,001 мл. Проводили инкубацию : Втлимфоцитов с ионоклональными анти телами при +5°С в течение 8 мин, по

закапывают по 0,005 мл нейтрального формалина для фиксации реакции. Учет реакции проводят на инвертированном

микроскопе МБИ-14 и выражают в процентах. Подсчитывают число погибших клеток на 100 клеток в каждой лунке. Разница между процентом погибших клеток на 100 клеток- в каждой лунке. Разница между процентом погибших клеток в контроле и опыте является результатом теста и отражает процент В-клеток, прореагировавших с монокло- нальными антителами Д8/17. Положительным считают результат более 10%.

П р HNM е р 1. Больной Е., 21 год. Заболел в ноябре 1988 года через 2 недели после ангины, когда появились боли и припухлость в крупных суставах. В апреле 1989 года на фоне мигрирующего артрита стал отмечать боли в области сердца и сердцебиения, в связи с чем был госпитализирован. После полного клинико-лабораторного обследования был поставлен диагноз: ревматизм в активной Лазе. Первичный ревмокардит. Формирующийся митральный порок сердца. Н-0.

Для выявления генетического маркера ревматизма -аллоантигена В-лимфоцитов Д8/17, был применен предлагаемый метод. Выделенные В-клетки вносили в тестовые лунки микрокамеры в количестве 0,001 мл в каждую; в опытные лунки были предварительно закапаны моноклопальные антитела Д8/17 в количестве 0,001 мл. Проводили инкубацию : Втлимфоцитов с ионоклональными антителами при +5°С в течение 8 мин, пос

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическон диагностике ревматизма. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа диагностики ревматизма. Для достижения цели маркер ревматизма - алло- антиген В-лимфрцитов Д8/17 - выявляют , в микролимфоцитотоксическом тесте, что не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, упрощает и сокращает время диагностики.

микрошпрнцом типа Гамильтон: 1 - MOHOTJO ле чего добавляли во все лунки

клональные антитела Д8/17 в количестве 0,001 мл в центр опытных лунок (всего использовали 6 лунок микрокамеры:. 3 первые контрольные, 3 Опыт0, 005 мл комплемента. Инкубацию на этапе комплемента проводили в течение 20 мин при 37,5°С. Производили окраску и фиксацию так же, как описано раные) 2 - В-лимфоциты, полученные по- 45 нее В результате, исследования выяпле еле разделения на колонках с нейлоновой ватой, в количестве 0,001 мл вносят в каждую тестовую лунку (3 контрольные и 3 опытные). Тщательно перемешивают в опытных лунках мо- CQ ноклональные антитела Д8/17 с В-клст- ками. Затем микрокамеры инкубируют 10 мин при температуре +4° С. После инкубации в каждую лу 4КУ закапывают J,JG5 мл свежеразморожснного комплемента и помещают в термостат на 5 мин при температуре 37°С. Затем в каждую лунку добавляют по 0,003 мл эозина для окрашивания. Через 2 мин

ю

но 20% положительных В-клсток, что свидетельствовало о наличии на В-лим- фоцитах данного больного аллоантигена Д8-17-генетического маркера ревматизма и подтверждало диагноз.

П р и м е р 2. Больная К-ва, 11 лет В 1986 г у больной после переохлаждения отмечались явления артрита с преимущественным поражением мелких суставов стоп, голеностопных, коленных суставов, лихорадка до 37,4 С. Состояние было расценено как ревматопдный артрит по поводу которого в течение нескольких месяцев проводилось лечение. В ян0, 005 мл комплемента. Инкубацию на этапе комплемента проводили в течение 20 мин при 37,5°С. Производили окраску и фиксацию так же, как описано ранее В результате, исследования выяпле

но 20% положительных В-клсток, что свидетельствовало о наличии на В-лим- фоцитах данного больного аллоантигена Д8-17-генетического маркера ревматизма и подтверждало диагноз.

П р и м е р 2. Больная К-ва, 11 лет. В 1986 г у больной после переохлаждения отмечались явления артрита с преимущественным поражением мелких суставов стоп, голеностопных, коленных суставов, лихорадка до 37,4 С. Состояние было расценено как ревматопдный артрит, по поводу которого в течение нескольких месяцев проводилось лечение. В ян

варе 1989 года после ангины на фойе вновь появившихся явлении артрита впервые были отмечены гиперкинезы, раздражительность, плаксивость. При, обследовании в клинике у больной выявлен эндомнокардит, малая хорея, что в сочетании с лабораторными данными позволило поставить диагноз: ревматизм в активной фазе, II ст. активности. Эндомиокардит с поражением митрального клапана. Малая хорея. Под- острое течение Н-о. Перенесенный ранее артрит расценен как первая атака ревматизма.

Проведено выявление генетического маркера ревматизма В-клеточногоалло- антигена Д8/17 в микролимфоцитотокси- ческом тесте. Были получены-В-лимфо- циты, как описано в примере 1. Моно- клональные антитела Д8/17, внесённые в тестовые опытные лунки микрокамеры, смешивались с 0,001 мл В-клеточной суспензией. В-клетки были также внесены в лунки опыт. Инкубация проводилась в течение 12 мин при температуре А С, после чего в лунки добавляли комплемент в количестве 0,005 мл, микрокамера помещалась в термостат при температуре 38,С на 20 мин. Затем проводилась окраска и фиксация, как

5

0

0

5

описано в примере 1. При подсчете результата реакции получено 22% положительных В-клеток, что подтверждает правильность постановки диагноза.

Способ позволяет обнаружить алло- антиген Д8/17 у 96% больных, что свидетельствует о закономерном характере носительства данного маркера у больных ревматизмом. Использование спосо

ба позволит без больших материальных затрат ускорить и упростить диагностику ревматизма.

Формула изобретения

N

Сио с об диагностики ревматизма путем инкубации В-клеток с моноклональ- нымй антителами Д8/17 с последующей оценкой результатов реакции иммуноло- гическим методом и при выявлении носительства аллоантигена В-лимфоцитов диагностируют ревматизм, о т л и - чающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, инкубацию осуществляют при 4-5 С в течение 8-12 мин, дополнительно вносят комплемент и инкубируют при 37 - 38 С в течение 20-25 мин, а результаты реакции оценивают с помощью лимфоцито- токсического теста.