СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза (РС).

Известная иммунодиагностика РС основана на обнаружения в крови больных серологическими методами, а именно реакциями связывания комплемента, пассивной гемагглютинации, противомозговых, противотимоцитарных антител. Эти методы недостаточно чувствительны, так как дают по различным данным от 5 до 83% положительных результатов, причем нередки среди них ложноположительные. Кроме того, диагностика с их помощью осуществляется поздно - через несколько лет от начала заболевания.

Цель изобретения: повышение чувствительности, специфичности диагностики заболевания.

Предлагаемый способ диагностики основан на характерном только для больных РС свойстве их иммунной системы не реагировать на вводимый серотонин.

Новизна способа заключается в том, что лимфоциты крови больного РС, взятые до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1-ного раствора серотонина соединяют в геле с эритроцитами барана, обработанными серотонином, выдерживают при температуре 37-37,5^оС в течение 60-90 мин и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 10⁶-10⁷/мл диагностируют рассеянный склероз.

Способ осуществляют следующим образом. Кровь забирают в пробирки с гепарином (50 ед/мл) и разводят средой 199, подкисленной КН₂РО₄ до цвета "чайной розы", при соотношении 1: 3. На 3 мл фиколл-верографина (24 ч 9% -ного фиколла и 10 ч 34% -ного верографина) наслаивают 8 мл разведенной крови и смесь центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин. Взвесь лимфоцитов из интерфазы дважды путем центрифугирования в 5 мл среды 199 в течение 10 мин (1500 об/мин) отмывают от фиколл-верографина, затем ресуспендируют в 1 мл среды 199. Клетки подсчитывают в 3% -ном растворе уксусной кислоты с генциан-виолетом (0,05% ), после чего концентрацию клеток доводят средой 199 до 10⁶ в 1 мл.

Бляшкообразующие лимфоциты среди клеток крови выявляют прямым пассивным локальным гемолизом в геле. В качестве геля используют агарозу. Готовят 0,75% -ный раствор агарозы на однократном растворе Хенкса, разогревая ее в колбе на кипящей водяной бане. Горячий раствор фильтруют через ватный фильтр и разливают в пробирки по 1 мл, помещают затем в ультратермостат при температуре 45^оС. В качестве индикаторных эритроцитов используют эритроциты барана, обработанные хлористым хромом и нагруженные серотонином. При приготовлении индикаторных эритроцитов 0,2 мл 50% -ной взвеси тщательно отмытых нативных эритроцитов барана соединяют с 0,1 мл свежеприготовленного раствора хлорида хрома в концентрации 10 мг/мл и с 0,1 мл раствора серотонина в концентрации 20 мг/мл. Смесь выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре, затем дважды отмывают средой 199 и доводят той же средой до первоначального объема (0,2 мл). Эти эритроциты используют в реакции в концентрации 10⁹ клеток на 10 мл агарозы. Суспензию лимфоцитов крови дважды отмывают раствором Хенкса, не содержащим ионы Са⁺⁺ и М⁺⁺. Конечная концентрация ядросодержащих клеток, используемая в реакции, составляла 10⁶ клеток/мл. Поле приготовления суспензии эритроцитов и клеток крови помещают на 20 мин в ультратермостат при температуре 45^оС. После того, как приготовлены все необходимые материалы для постановки реакции, достают из ультратермостата пробирку с агарозой и вносят в нее рабочие объемы эритроцитов барана и исследуемых лимфоидных клеток, быстро и тщательно перемешивают смесь. Эту смесь в объеме 1,5 мл разливают на горизонтальном столике в предварительно подогретые в термостате чашки "Орион" диаметром 5 см. Быстрым круговым движением распределяют слой агарозы по чашке. Для полного застывания агарозы чашки оставляют на горизонтальном столике на 15 мин, после чего инкубируют их в термостате при температуре 37-37,5^оС в течение 60-90 мин. Через час, сняв крышки с чашек и дав агарозе чуть подсохнуть, наливают на слой агарозы в каждой чашке 1,5 мл раствора комплемента и вновь инкубируют чашки в течение часа при температуре 37^оС. В качестве комплемента используют лиофилизированную сыворотку морской свинки производства ПНИИВС ("Сухой комплемент"). Содержимое ампулы (1 мл сухого комплемента) разводят в 5 мл среды 199, получая 20% -ный раствор, который используют в реакции. Учет реакции производят путем подсчета зон просветления ("бляшек") в проходящем свете, отмечая их с обратной стороны чашки карандашом "стеклограф". Число зон лизиса подсчитывают среди 10⁶-10⁷ жизнеспособных лимфоцитов.

Результаты исследований приведены в табл. 1-3.

П р и м е р 1. Больная З. , 37 лет, инвалид II группы, повторно поступила в клиническое отделение нервных болезней 1 февраля 1989 года с жалобами: слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, двоение, снижение зрения, периодическое нарушение функций тазовых органов. Из анамнезов известно, что больна с 1978 г. , течение заболевания ремиссирующее, обострения отмечались в 1982, 1985, 1987 г.

При осмотре отмечено: патологии со стороны внутренних органов нет. Р - 68 уд/мин. АД 120/80 мм рт. ст.

Неврологически: горизонтальный нистагм в обе стороны, речь дизартрична. Спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Выраженная статическая и динамическая атаксия.

Анализ мочи и крови без патологии.

На обзорной кардиограмме изменений нет. Глазное дно: декопорация височных половин дисков зрительных нервов.

Установлен диагноз: рассеянный склероз, цереброспинальная форма.

У больной до и через 30 мин после подкожного введения 0,5 мл 0,1% -ного раствора серотонина забрали кровь из пробирки с гепарином (50 ед/мл) и развели средой 199, подкисленной КН₂РО₄ до цвета "чайной розы" при соотношении 1: 3.

На 3 мл фиколл-верографина /24 ч 9% -ного фиколла и 10 ч 34% -ного верографина/ наслоили 8 мл разведенной крови и смесь процентрифугировали 45 мин при 400 (1500 об/мин). Взвесь лимфоцитов из интерфазы дважды путем центрифугирования в 5 мл среды 199 в течение 10 мин (1500 об/мин) отмывали от фиколл-верографина, затем ресуспендировали в 1 мл среды 199. Клетки подсчитали в 3% -ном растворе уксусной кислоты с генциан-виолетом (0,05% ), после чего концентрацию клеток довели средой 199 до 10⁶ в 1 мл. Бляшкообразующие лимфоциты среди клеток крови выявляли прямым пассивным локальным гемолизом в геле. В качестве геля использовали агарозу. Готовили 0,75% -ный раствор агарозы на однократном растворе Хенкса, разогревая ее в колбе на кипящей водяной бане. Горячий раствор фильтровали через ватный фильтр и разливали в пробирки по 1 мл, затем помещали в ультратермостат при температуре 45^оС. В качестве индикаторных эритроцитов использовали эритроциты барана, обработанные хлористым хромом и нагруженные серотонином. При приготовлении индикаторных эритроцитов 0,2 мл 50% -ной взвеси тщательно отмытых эритроцитов нативных соединяли с 0,1 мл свежеприготовленного раствора хлорида хрома в концентрации 1% мг/кг и с 0,1 мл раствора серотонина в концентрации 20 мг/кг. Смесь выдерживали в течение 5 мин при комнатной температуре, затем дважды отмывали средой 199 и доводили той же средой до первоначального объема (0,2 мл). Эти эритроциты использовали в реакции в концентрации 10⁹ клеток на 10 мл агарозы. Суспензию лимфоцитов крови дважды отмывали раствором Хенкса, не содержащим ионов Са⁺⁺ и М⁺⁺. Конечная концентрация ядросодержащих клеток, используемая в реакции, составляла 10⁶ клеток/мл. После приготовления суcпензии эритроцитов и клеток крови помещали на 20 мин в ультратермостат при температуре 45^оС.

После того, как были приготовлены все необходимые материалы для постановки реакции, доставали из ультратермостата пробирку с агарозой и вносили в нее рабочие объемы эритроцитов барана и исследуемых лимфоидных клеток, быстро и тщательно перемешивали смесь. Эту смесь в объеме 1,5 мл разливали на горизонтальном столике в предварительно подогретые в термостате чашки "Орион" диаметром 5 см. Быстрым круговым движением распределяли слой агарозы по чашке. Для полного застывания агарозы чашки оставляли на горизонтальном столике на 15 мин, после чего инкубировали их в термостате при температуре 37^оС в течение часа. Через час, сняв крышки и дав агарозе чуть подсохнуть, наливали на слой агарозы в каждой чашке 1,5 мл раствора комплемента и вновь инкубировали чашки в течение часа при температуре 37^оС. В качестве комплемента использовали лиофилизированную сыворотку морской свинки производства ПНИИВС ("Сухой комплемент"). Содержимое ампулы (1 мл сухого комплемента) разводили в 5 мл среды 199, получая 20% -ный раствор, который использовали в реакции. Учет реакции производили путем подсчета зон просветления ("бляшек") в проходящем свете, отмечая их с обратной стороны чашки карандашом "стеклограф". Число зон лизиса подсчитывали среди 10⁶ жизнеспособных лимфоцитов.

Число бляшек среди лимфоцитов крови больной в ответ на введение серотонина не изменилось (2 на 10⁶ яск до 2,8 после введения серотонина). Подтвержден клинический диагноз рассеянного склероза.

П р и м е р 2. Больная Л. , 35 лет. Поступила в клинику 18 января 1989 г. с жалобами на слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, снижение зрения. Больна в течение полугода, когда стала отмечать нарастающую слабость в ногах, пошатывание. При осмотре патологии со стороны внутренних органов не выявлено. Р 76 уд. мин. АД 130 мм рт. ст. Неврологически: эйфория. Горизонтальный нистагм в обе стороны. Спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Интенциональный тремор с двух сторон. Не устойчива в позе Ромберга. На краниограмме патологии нет. Глазное дно без изменений. Установлен диагноз: дебют рассеянного склероза, цереброспинальная форма. Диагноз подтвержден иммунологическим исследованием крови, так как число бляшек, выявленных среди 10⁶ лимфоцитов крови, составляло до введения серотонина 1,8, после введения 2,0. Эти данные позволили подтвердить клинический диагноз дебюта рассеянного склероза.

П р и м е р 3. Больная К. , 38 лет. Поступила в клинику неврологии 26 августа 1988 г. с жалобами на боли в пояснично-крестцовой области иррадиацией в левую ногу. При осмотре отмечено: сглажен поясничный лордоз, дефано мышц спины, положительный симптом Ласега справа, гипестезия по наружной поверхности правой голени. Правый ахиллов рефлекс не вызывается. На спондилограмме снижен диск между 4-5 поясничными позвонками, выраженный сколиоз.

Диагноз: остеохондроз пояснично-крестцового отдела позвоночника, грыжа диска, компрессия пятого поясничного корешка справа. У больной исследована кровь заявляемым способом.

Pезультат: число бляшек среди 10⁶ лимфоцитов крови до введения серотонина 8,0, после введения 62,5. Заболевание рассеянным склерозом исключается абсолютно.

П р и м е р 4. Больная А. , 30 лет, практически здорова. Исследовали кровь описанным способом. У обследуемой выявлено среди 10⁷ ядросодержащих клеток крови 4,0 бляшкообразующих лимфоцитов до и 60,0 после введения серотонина. Заболевание РС исключается абсолютно.

Результаты осуществления предлагаемого способа с использованием 10⁷ на мл исследуемых лимфоцитов, 10¹⁰ эритроцитов, инкубации длительностью 90 мин при температуре 37^оС, приведены в табл. 4. Результаты реализации предлагаемого способа с использованием 10⁶ на мл исследуемых лимфоцитов, 10⁹ эритроцитов, инкубации длительностью 60 мин при температуре 37^оС, также приведены в табл. 4.

Преимущества способа заключаются в его высокой точности, специфичности, высокой чувствительности, возможности с его помощью осуществлять очень раннюю диагностику рассеянного склероза, еще до клинических проявлений заболевания, в том числе в детском возрасте, в возможности диагностики дебютов заболевания, стертых и атипичных его форм, поскольку диагностика основана на присущем всем больным РС и лицам с факторами риска, впервые установленном наследственном иммунодефиците - свойстве иммунной системы больных рассеянным склерозом не реагировать на вводимый в их организм серотонин. (56) Авторское свидетельство СССР N 1564546, кл. G 01 N 33/48, 1990.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза (РС). Цель изобретения: повышение чувствительности, специфичности и точности способа диагностики РС, особенно дебюта, стертых и атипичных форм заболевания. С целью повышения чувствительности и специфичности способа лимфоциты крови больного, взятые до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1% -ного раствора серотонина соединяют в геле с эритроцитами барана, обработанными серотонином, выдерживают при температуре 37 - 37,5С в течение 60 - 90 мин и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 10⁶-10⁷ на 1 мл диагностируют рассеянный склероз. 4 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА путем исследования крови, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, лимфоциты крови больного, взятые до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1% -ного раствора серотонина, соединяют в геле с эритроцитами барана, обработанными серотонином, выдерживают при 37 - 37,5^oС в течение 60 - 90 мин и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 10⁶ - 10⁷ на 1 мл диагностируют рассеянный склероз.