Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий BacILLUS SUвтILIS и BacILLUS LIснеNIFоRмIS Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

евая соль оксиэтилендифосфоновой кислоты (МпК2Р2С207Н4) и меднокалиевая соль оксиэтилендифосфоновой кислоты (СиКаРаСаОтН) являются дифицитными и дорогостоящими.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы, увеличение антагонистической актианости бактерий и их устойчивости к ЛИОФИЛЫ10Й сушке.

Способ приготовления питательной среды включает следующие операции: отбор компонентов среды в количествах согласно рецертуре; соединение компонентов среды за исключением хлоропластной фракции; кипячение смеси 20-30 мин до полного растворения агар-агара; фильтрацию среды через ватно-марлевый фильтр; хлоропластную фракцию растирают с незначительным количеством среды, после чего добавляют в основной объем среды; рззливают в бактериологические матрацы по 0,3 л и автоклавируют (стерилизуют) текучим паром при избыточном давлении 0.5 атм в течение 30 мин.

Способ получения хлоропластной фракции из люцерны включает механическое обезвоживание листостебельной биомассы, которую разделяют на пресс-остаток и жидкую фракцию - зеленый (клеточный) сок. Затем зеленый сок, имеющий рИ 6,0, нагревают до 53°С, выдерживают при этой температуре в течение 3 и центрифугируют. Осадок представляет собой хлоропяастную фракцию, которую вводят s состав питательной среды.

Хлоропластная фракция зеленого сока.. полученного из листостебельной биомассы люцерны, содержит белки и свободные аминокислоты со сбалансированным .составом незаменимых аминокислот, а также комплекс витаминов, углеводы, фосфолипиды, стимулятор роста растений триоконтанол и ряд минеральных оеществ. В отличие от зеленого сока о ней не содержатся сапонины. полифенолы, ингибиторы ферментов и хелатообразующие вещества, которые подавляют рост бактерий, сннжают их антагонистическую активность и устойчивость кнеблагоприятным факторам. Вследствие оптимального состава органических и минеральных веществ, входящих в хлоропластную фракцию, ее введениев питательную среду существенно повышает выход -юмассы спорообразующих аэробных бактерий, например В. subtliis и B.Hoheniformis, а также увеличивает их анта онистическую активность и устойчивость к неблагоприятным факторам.

Введение хлоропластной фракции в состав питательной среды позволяет исключить из нее микроэлементы (Мп и Си, что обусловлено наличием в хлоропластной фракции данных ионов, входящих в состав активных центров кислооодвыделяющей системы хлоропластов (Мп) и в состав пластоцианина (Си.

Кроме того, введение хлоропластиой фракции в состав питательной среды позволяет уменьшить в два раза содержание в

ней гидролизата мяса. Благодаря эффекту взаимного обогащения белков животного и растительного происхождения и ее оптимальному для спорообразующих аэробных бактерий составу увеличивается выход биомассы, повышается антагонистическая активность и устойчивость бактерий к неблагоприятным факторам. Это проявляется в более высокой выживаемости бактерий после лиофилизации и более высокой

антагонистической активности по отношению к тест-микробам.

Для экспериментальной проверки состава питательной среды подготовлено б вариантов среды.состав которых приведен в

табл. 1.

После приготовления каждый вариант различают в 50 бактериологических матрацев по 0,25 л и стеризируют текучим паром с избыточным давлением 0.5 атм в течение

30 мин.

Засев питательных сред в матрацах производят одной и той же маточной культурой B.subtilis и отдельно B.lichenlformis. содержащей в 1 мл 1 млрд. микробных тел

(по оптическому стандарту мутности). В каждым матрац вносят 10 мл одной из указанных бактериальных взвесей, которую равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды. Матрацы помещают а термостат с температурой, 28°С. Выроси}ую бактериальную пленку на 2-5 12-й день роста собирают с каждого матраца отдельно с помощью шпателя и 0.85 %-ного раствора натрия хлорида. Полученную взвесь бактерий с хлопьями пленки гомогенизируют путем пропускания через стерильный медицинский шприц с насаженной игпой. В гомогенной бактериальной взвеси определяют количество микробных

тел на 1 мл питательной среды и вычисляют средние данные по каждой группе исследований. .

Результаты экспериментов приведены в табл.2.

На видно из табл. 2, питательные среды

3-6 обеспечивают увеличение выхода биомассы по сравнению с известной питательной средой. Питательная среда 2, содержащая хлоропластную фракцию в количестве 25 г/л, не позволяет получать выход биомассы более высокий, чем на известной среде. Питательная среда 6, содержащая хлоропластную фракцию в количестве 125 г/л, обеспечивает практически такое же увеличение выхода биомассы, как и питательная среда 5, содержащая 100 г/л хлоропластнойфракции.Из-за

необоснованного перерасхода х лоропластной фракции питательную среду 6 использовать нецелесообразно.

Наилучшие результаты по выход/ биомассы получают при содержании хлоропластной фракции в составе питательной среды 50- 100 г/л. Использование такой питательной среды позволяет повысить выход биомассы в среднем на 75 % по сравнению с известной питательной средой,

Введение в состав питательной среды хлоропластной фракции позволяет получа гь спорообразующие аэробные бактерии с высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам. К их числу относятся условия лиофилизации.

Проведены опыты гю определению влияния процесса лиофилиз-тции на жизнеспособность (выживаемость) бактерий. предваритег1ьно выращенных на питательной среде, содержащей хлоропластную фракцию, и известной питательной среде.

Для этого взвеси бактерий, выросших на известной и предлагаемой питательных средах, содержащих по 100 млрд. микробных тел в 1 мл (по оптическому стандарту), разливают по 1 мл в одинаковые стеклянные флаконы емкостью 5 мл, замораживают при минус 40°С в течение 24 ч и лиофилизируют в течение 36 ч до остаточной влажности 3-4 %. Для определения количества живых бактерий после процесса лиофилизации во флакон вводят 1 мл 0,85 %-ного раствора хлорида натрия. В дальнейшем, используя метод последовательных 10-кратных разведений о стерильном растворе 0,85 %-ного натрия хлорида, из пробирок с разведениями 1:107 - 1:108 делают высев на мясопептонный агар (по 3 чашки на разведение). Чашки с посевами помещают в термостат при 37°С и через 18-20 ч производят подсчёт выросших колоний. Предварительно перед замораживанием по такой же методике определяют количества живых бактерий в каждой микробной взвеси.

Средние данные проведенных исследований представлены в табл. 3.

Данные табл. 3 показывают, что состав питательной среды, на которой выращивают бактерии, имеют важное значение для их выживания в процессе лиофилизации. Так, предварительное выращивание на предлагаемой питательной среде в 1.5-1,6 раза повышает выживаемость бактерий B.subtiMs и B.llchenlformi$ после лиофилизации по сравнению с выживаемостью этих же бактерий, выросших на известной питательной среде.

Для определения антагонистической активности бактерий, выросших на известной и предлагаемой питательных средах, используют тест-микробы. Содержимое флЕкона (высушенный препарат бактерий) растворяют стерильной водопроводной водоь. и петлей производят посев пятном 0,5 см в диаметре в центре чашки Петри с мясопептонным агаром. После выдерживания чйшкм а термостате в течение 48 ч штрихом от периферии к центру наносят посевной материал тест-бактерий (1 млрд. взвеси тест-бяктерий, разведенные в 0,85 %-ном растворе натрия хлорида в 5 раз).

Результаты опытов приведены в табл. 4. Таким образом. B.subtilis и B.licheniformis. выращенные на предлагаемой питательной среде и подвергнутые последующей лиофилизации. обладают антагонистической активностью, а 1.5--2 раза превышающей таковую этих же бактерий, выращенных на иззестной питательной среде.

Использование изобретения позволяет

повысить выход биомассы, увеличить выживаемость при лиофилизации и антагонистическую активность спорообразующих аэробных бактерий, а также снизить расходы на технологический процесс выращивания данных микроорганизмов.

Формула изобретения Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, содержащая пивное сусло, гидролизат мяса, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, увеличения антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке, среда дополнительно содержит хлоропластную фракцию зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пивное сусло500.0-600,0

Гидролизат мяса50.0-60.0

Хлоропластовая фракция зеленого сока, полученного из листостебельной

биомассы л оцерны50,0-100,0

Агар-агар25.0-30,0

ВодаОстальное

Таблица 1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть ис- ползовано в производстве бактерина-СЛ идругих технологических процессах, где применяются спорообразующие аэробные микроорганизмы рода Bacillus. Цель изобретения - повышение выхода биомассы, увеличение антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке. В питательную среду, содержащую в качестве основы агаризован- ную среду на пивном сусле и гидролизат мяса, дополнительно вводят хлоропластную фракцию зеленого сока, полученного из ли- стостебельной биомассы люцерны, при следующем соотношении компонентов, г/л: пивное сусло 500-600: гидролизат мяса 50- 60; хлоропластная фракция зеленого рока, полученного из листостебельной биомассы люцерны 50-100; агар-агар 25-30: вода остальное. Использование питательной среды позволяет повысить выход биомассы в среднем на 75 %, выживаемость бактерий после лиофилизации в 1,5- 1,6 раза, увеличить их антагонистическую активность в 1,5-2,0 раза. 4 табл.Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть ис- поль^овано в производстве бактерина-СЛ и других технологических процессах, где применяются спорообразующие азробные мик- ооорганизмы рола Bacillus.Наиболее близкой предлагаемой является питательная среда на основе пивного сусла, обогащенная мясным гидролизатом и; микроэлементами Мп'^'^ и Си'^*, следующего состава, г/л:Пивное сусло500,0-600,0Гидролизат мяса100,0-120,0Мп^""0,01-0,05Си^^0,003-0,005Агар-агар25,0-30,0ВодаОстальноеНа известной комбинированной питательной среде происходит рост и размножение B.subtllfs и B.llcheniformls. Однако процесс накопления биомассы при длительном культивировании происходит недостаточно знергично. Кроме того, выращенные на питательной среде B.subtilis и B.llcheniformls обладают низкой устойчивостью к неблагоприятным факторам и антагонистической активностью. Входящие в состав питательной среды марганцевокали-V4О 00 00 00ю

Т а б лица 2,

Таблица 3

Таблица 4