Питательная среда для дифференциации Bacillus anthracis Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к составу питательной среды для дифференциации возбудителя сибирской язвы.

Известна, жидкая питательная среда ПСИ, содержащая 60% раствора Хенкса и 40% бычьей сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы по ее способности к капсулообразованию (См. кн. Колесов С.Г. Сибирская язва. - М.: Колос, 1976. - С. 104).

К недостаткам известной питательной среды относится то, что она не является оптимальной по составу, поскольку она обеспечивает капсулообразование не более 60-80% сибиреязвенных микробов.

Известна также питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы по способности капсулообразования с использованием столовой минеральной воды (А.с. СССР №1533324 А1С 12 №1/20. 04.04.1988).

Недостатком данной среды является то, что в качестве стимулятора капсулообразования используют пищевой продукт (столовую минеральную воду), который в экспериментальных условиях (полевых, в отдаленных и южных регионах страны) бывает малодоступным.

Известна яично-желточная среда для дифференциации B. anthracis от близкородственных сапрофитов (Груз Е.В. Диагностическая ценность некоторых морфологических, культуральных и биохимических признаков палочки антракса // Антракс, Кишенев «Картя Молдаваняскэ», 1964; С. 124-128; Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. - М., 1980. С. 60).

Недостатками среды являются непостоянство проявления признака лецитиназообразования как у сибиреязвенных штаммов, так и у близкородственных бацилл, а также невозможность проведения дифференциации капсулообразующих и бескапсульных штаммов B. anthracis. Среда не позволяет одновременно проводить выделение возбудителя сибирской язвы и дифференциацию его от близкородственных сапрофитов.

Известна, также питательная среда для выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы от близкородственных споровых сапрофитов, содержащая питательную основу (гидролизат кильки, дрожжевой экстракт, ферментативный гидролизат мяса или рыбы и т.д.), Д-сорбит, агар-агар, вода - остальное (Пат. RU №2125610, МПК С120 1/02, опуб. 27.01.99 г.). Недостатками среды являются: 1) сложность состава среды; 2) дороговизна (использование дорогостоящих и дефицитных компонентов: ферментативные гидролизаты мяса, рыбы, Д-сорбит, бромтимоловый синий); 3) субъективная оценка результатов дифференциации по цвету и морфологии колоний: желто-зеленая и зеленое - вирулентные и авирулентные штаммы возбудителя сибирской язвы и сине-зеленое - близкородственные сапрофиты. Такая оценка результатов весьма неубедительна, поскольку она затруднена не только дальтоником, но и для исследователей с нормальным зрением; 4) наличие диссоциации в монокультуре вирулентной сибиреязвенной культуры обуславливает расщепление отдельных клонов по цвету и морфологии, что вносит путаницу в достоверности идентификации возбудителя.

Наиболее близкой к изобретению является плотная питательная среда с кровяным агаром, где возбудитель сибирской язвы создает зону гемолиза, что может служить дифференциальным признаком возбудителя от близкородственных сапрофитов (См. кн. Сибирская язва сельскохозяйственных животных / Н.Г. Ипатенко и др. - М.: Агропромиздат, 1987. - С. 155).

Недостатком среды является непостоянство проявления признака лецитино-образования как у сибиреязвенных штаммов, так и у близкородственных бацилл.

Так, при исследовании 47 сибиреязвенных штаммов и 97 сходных с ними ложносибиреязвенных сапрофитов не выявлены резко выраженные дифференциальные признаки возбудителя.

Следует отметить, что персистируя во внешней среде (почве, воде, навозе и в организме) возбудитель сибирской язвы претерпевает изменения таксономических признаков, в частности, способности к капсулообразованию, которая может быть временной (фенотипическое изменение) или длительной (генотипическое изменение), что создает трудности при идентификации и дифференциации возбудителя, при которых существующие тест-системы теряют эффективность.

Следовательно, при бактериологическом исследовании с использованием известных питательных сред исследователи наталкиваются на значительные трудности в определении вида бацилл среди разнообразнейшей бактериальной среды.

Основную трудность при дифференциации возбудителя сибирской язвы создают близкородственные спорообразующие аэробные сапрофитные бациллы: B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, В. thuringienis, которые имеют общие антигены, сходные морфологические и биохимические свойства с возбудителем сибирской язвы.

Вегетирование возбудителя сибирской язвы в почве может сопровождаться изменениями основных свойств за счет возможного обмена генетической информацией как внутри вида, так и с близкородственными спорообразующими сапрофитами, особенно с B. cereus и В. thuringiensis. О степени родства последних и возбудителя сибирской язвы свидетельствует 100% гомология хромосомной ДНК. (Kaneko Т., Nosaki R., Aisava K., // Jap. J. microbiol. - 1978. V. 22. - №10. p. 639-641).

При этом различают ауксотрофные и тропотрофные микроорганизмы. Ауксотрофы - микроорганизмы, утратившие способность синтезировать одно из веществ, необходимых для их роста (аминокислоту, витамины и др.). Без добавления в питательную среду этих веществ ауксотрофы не растут (например, возбудитель сибирской язвы).

Тропотрофы - B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, В. thuringiensis - давали рост на плотной минимальной питательной среде с единственным органическим компонентом глюкозой - основным источником углевода и энергии.

Известно, что в процессе своего метаболизма некоторые штаммы бактерий рода Bacillus, в том числе B.cereus, B.subtilis, В. mesentericus, В. thuringiensis, способны синтезировать фруктаны - невосстанавливающие полисахариды (полимеры фруктозы). В зависимости от типа связи между остатками фруктозы, фруктаны делятся на два типа: инулин и леван. Вышеназванные бактерии (близкородственные с возбудителем сибирской язвы) синтезируют β - 2,6 - связанные полисахариды - леваны. Синтез леванов происходит внеклеточно и осуществляется одним ферментом - леван сахарозой. При росте на среде, богатой сахарозой, бактерия выделяет этот фермент, который расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу; при этом остаток фруктозы переносится на другую молекулу сахарозы.

Вся глюкоза потребляется микроорганизмом, а фруктоза полимеризуется ферментом с образованием левана (Преображенская М.Е. Декстраны и декстраназы // Усп. биол. хим. - 1975. - Т. 16. - С. 214-335; Walker G.J. Internet Rev. of Biochem // Biochem jf Carbon - hydrate. - 1978. - V. 6. - P. 75-126; J. Yudkin, J. Cdelman, C. Hough Sugar - Chemical, Biological and Nutritional Aspete of Suerose // The Butter-worth Jzoup. - 1971, 1973; Сапронов A.P. Технология сахарного производства. - M.; Колос, 1999. - С.495).

Следовательно, синтез леванов на среде культивирования испытуемых микроорганизмов может служить одним из важнейших таксономических (дифференциальных) признаков близкородственных аэробных бацилл, отличающих их от возбудителя сибирской язвы.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в создании стабильной и эффективной питательной среды для дифференциации возбудителя сибирской язвы от близкородственных почвенных аэробных бацилл.

Для достижения этого технического результата в предлагаемом способе, содержащем мясо-пептонный агар (МПА), он дополнительно содержит при следующем соотношении и компонентов об.%: мясо-пептонный агар - 89-90, сахароза - 10-11.

Это позволяет стабильно и эффективно проводить одновременно выделение и дифференциацию B. anthracis, за счет использования мясо-пептонного агара и сахарозы - как стимулятора синтеза - левана, продукта метаболизма близкородственных сапрофитов, сократить время выделения и дифференциации возбудителя сибирской язвы до 16-18 часов, исключить из состава питательной среды дорогостоящих компонентов - раствора Хенкса, сыворотки крови и кровяного агара.

Предлагаемую питательную среду готовят следующим образом. Мясо-пептонный агар, содержащийся в стеклянной колбе в количестве 500 мл, растапливают в водяной бане при 100°C, добавляют 10 гр сахарозы на 100 мл среды. После полного растворения сахарного песка (сахарозы) полученную питательную среду (100 мл МПА + 10% сахарозы) разливают в чашки Петри, помещают в термостат при 37°C на 30 минут для подсушивания и освобождения от конденсата. Питательную среду, разлитую в чашки Петри, после подсушивания используют для посева испытуемого материала для идентификации и дифференциации выросших культур.

Дифференциация возбудителя сибирской язвы с использованием предлагаемой питательной среды иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Подготовленную по вышеописанному способу питательную среду засевают дробно (по Дригальскому), по три чашки на каждую культуру в отдельности: сибиреязвенную вирулентную культуру B.anthracis штамм 32, сибиреязвенный вакцинный штамм 55, близкородственные сапрофиты: B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, B. megaterium, B. pseudoanthracis, т.е. 7 культур по 3 чашки на каждую культуру, посевы термостатируют при 37°C в течение 16-18 часов. По истечении указанного времени проводят визуальный анализ выросших культур.

Результаты просмотра выросших культур показывают, что в чашках с испытуемой средой, в которые были засеяны штаммы сибирской язвы (B. anthracis 32 и B. anthracis 55), наблюдается обильный рост типичных сибиреязвенных культур с матовым оттенком во всех шести чашках.

А в посевах близкородственных сапрофитов: B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, B. megaterium, B. pseudoanthracis обнаруживали не только аналогичный обильный рост культур по всей чашке, но и на поверхности культур еще и обильное слизистое вещество - леван, продукт синтеза близкородственных к возбудителю сибирской язвы сапрофитов.

Многократные повторения аналогичных опытов дали идентичные результаты. Следовательно, появление на поверхности исследуемых (подозрительных на сибирскую язву) культур обильного слизистого вещества - левана, свидетельствуют о принадлежности их к роду Bacillus, но не к виду B. anthracis (возбудитель сибирской язвы).

При этом установлено, что вид B. anthracis независимо от степени вирулентности, способности к капсулообразованию или ее отсутствию, на используемой питательной среде не образуют слизистой субстанции - левана, что является дифференциальным критерием принадлежности исследуемых культур к виду B. anthracis (возбудитель сибирской язвы).

Пример 2. Определение оптимального соотношения компонентов питательной среды.

Для этого готовят питательные среды с различным соотношением компонентов: МПА (80%) + сахароза (20%); МПА (85%) + сахароза (15%); МПА (89%) + сахароза (11%); МПА (90%) + сахароза (10%); МПА (95%) + сахароза (5%).

Питательные среды с вышеуказанными соотношениями компонентов засевали вирулентным (B. anthracis 32) и вакцинным (B. anthracis 55) штаммами возбудителя сибирской язвы и близкородственными сапрофитами (B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, B. megaterium, B. pseudoanthracis) и просматривали посевы как в примере 1 при тех же условиях.

Установлено, что на среде с минимальной концентрацией сахарозы (5%) выход биомассы составлял 2,1 млрд. в 1 мл, а на средах как с максимальным (15, 20%), так и с оптимальной (10%) концентрацией сахарозы выход биомассы составлял 2,5 млрд./мл.

Следовательно, повышение концентрации сахарозы не приводит к увеличению биомассы, поэтому оптимальным соотношением компонентов в предлагаемой питательной среде является МПА - 90% и сахарозы - 10%.

Пример 3. Проверка эффективности питательной среды при индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.

Возбудитель сибирской язвы, попадая в почву, длительно переживает в ней в споровой форме и представляет серьезную проблему для ветеринарной медицины, поскольку наличие возбудителя на месте захоронения сибиреязвенных трупов представляет угрозу вспышки этой особо опасной инфекции. Поэтому обнаружение возбудителя в почве и его обезвреживание являются первостепенной задачей профилактики этого опасного зооантропоноза. Однако, выделение возбудителя в почве сопряжено большими трудностями, обусловленными, во-первых, незначительной концентрацией возбудителя в почве и, во-вторых, наличием в большом количестве в почве близкородственных к возбудителю сибирской язвы аэробных бацилл: B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, B. megaterium, B. pseudoanthracis, которые по культурально-морфологическим свойствам схожи с возбудителем сибирской язвы, который, персистируя в почве с указанными сапрофитами, приобретает сходные свойства (авирулентность, акапсулогенность, подвижность и т.д.). В этих условиях существующие методы и средства идентификации и дифференциации возбудителя теряют эффективность.

С учетом сказанного, провели опыты по выделению и идентификации возбудителя сибирской язвы с использованием предлагаемой питательной среды.

Для этого, пробы почвы, взятые с территории старых скотомогильников, после обработки в соответствии с «Инструкцией по выделению сибирской язвы из объектов ветнадзора», дробно высевали на МПА, термостатировали 16-18 часов при 37°C и просматривали посевы на наличие матовых и шероховатых (R-формы) колоний. Подозрительные на сибиреязвенную культуру колонии пересевали на предлагаемую питательную среду с последующим термостатированием и просмотром посевов как в примере 1.

Установлено, что из отобранных 53 колоний, подозреваемых на сибирскую язву, на испытуемой питательной среде только 2 колонии давали обильный рост микробов без образования обильного слизистого вещества - левана, в то время как культуры из 51 колонии, выращенных из проб почвы скотомогильников, на испытуемой питательной среде образовали обильное слизистое вещество - леван, что свидетельствует о принадлежности их роду Bacillus и видам B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus и B. megaterium, которые всегда присутствуют в почве, а также в растениях.

Таким образом, предлагаемая питательная среда позволяет:

- существенно ускорить время выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды;

- достоверно дифференцировать возбудителя сибирской язвы от близкородственных аэробных бацилл - сапрофитов: B. cereus, B. subtilis, В. mesentericus, B. megaterium, B. pseudoanthracis без применения для этой цели специальных питательных сред (ПСИ, гидрокарбонатную воду, МПА с кровью), дорогостоящие диагностикумы (энзиммеченые и флуорохроммеченые антитела), заражение восприимчивых животных, ибо эти тесты полностью подтвердили результаты идентификации возбудителя сибирской язвы с использованием предлагаемой питательной среды с сахарозой.

Изобретение относится к микробиологии и касается питательной среды для дифференциации сибиреязвенного микроба. Питательная среда для дифференциации B. anthracis содержит мясо- пептонный агар и сахарозу при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить степень дифференциации возбудителя сибирской язвы и сократить сроки дифференциации. 3 пр.

Плотная питательная среда для дифференциации B. anthracis, содержащая мясо-пептонный агар, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сахарозу при следующем соотношении компонентов, об. %:

мясо-пептонный агар 89-90 сахароза 10-11