Рекомбинатная плазмидная ДНК рВGНтRр 3, кодирующая гормон роста крупного рогатого скота, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент гормона роста крупного рогатого скота Советский патент 1992 года по МПК C12N15/18 C12N1/21 

Изобретение относится к микробиологической промышленности генетической инженерии и биотехнологии.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBGHtrp3, кодирующая гормон роста (ГР) крупного рогатого скота (КРС) под контролем промотора trp-оперона Е.соИ и содержащая фрагмент бактериального 183-элемента, расположенный после ген9 ГР КРС, Плазмидой трансформирован штамм Е.соИ DH1. Наличие в плазмиде фрагмента 153-элвмента стабилизирует продуктивность штамма продуцента и позволяет достичь высокого уровня синтеза целевого продукта, не прибегая к индукции. Уровень синтеза ГР КРС составляет около

20% от суммарного белка клетки или 50-60 мкг на 1 мл ночной культуры.

Рекомбинантная плазмида рВСНхгрЗ содержит репликон и гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину плазмиды рВг322, промотор trp-оперона E.coli, фрагмент, кодирующий ГР КРС, и фрагмент IS3злемента бактерии состоит из следующих элементов:

EcoRi-HInd III - фрагмента плазмиды PSTH2191 размером 5300 п.о., включающего участок начала репликации, гены устойчивости к ампициллину (Ыа) и тетрациклину (tet)H промотор trp-оперона Е.соМ:

EcoRl - Htnd ill - фрагмента, кодирующего ГР KnCi размером 601 п.о.:

Hind III - фрагмента IS3 злемента размером 916 п.о.

Размер плазмиды pBGHtrpS составляет 6819 п.о. Копийность плазмиды около 20 молекул на клетку.

ДНК плазмиды pBGHtrp3 содержит уникальные сайты рестрикции EcoRI, Hpal, Smal, BamH I, SalGI. EcoRV, 2 сайта рестрикции Hind III и 3 сайта рестрикции Pstl.

Штамм-продуцент ГР КРС получен трансформацией клеток E.col DH1 плазмидой pBGHtrpS.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые палочковидной формы грамотрицательные неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. При росте на питательной агаре Дифко колонии гладкие круглые блестящие серые. Края колоний ровные. При росте в жидких средах YT. LB, М9 образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования 37°С. оптимум рН от 6,8 до 7,5, В качестве

AATTCTATGTTCCCAGCTATGTCTCTATCTGGTCTATTGCTAACG

е/,s /

IIIill

VIVII. VIM

/ /ч((

() (.1Ii

GATACAAGGGtCGATACAGAGATAGACCAGATAAGCGATTGCGACAAG CTGTTCTTCGGGCCAGCATCTTCATCAGGTGA

-) ((IV

IX X fi.-j/

AAGCCCGGGTCGTAGAAGTAGTCGACTTCGA

Структура олигонуклеотидов выбрана с таким расчетом, чтобы синтетический фрагмент ДНК имел липкие концы для рестриктаз EcoRl и Hind III. Инициирующий АТС-коДон расположен перед кодоном 1-й аминокислоты зрелого ГР КРС-фенилаланина. В участке, соответствующем кодонам , предусмотрен сайт рестриктазы PVU il, позволяющий сшитьсинтетический фрагмент ДНК с фрагментом, кодирующим остальную часть молекулы ГР (остатки 24-190).

Фосфорилирование и сшивку олигонуклеотидов проводят следующим образом.

5 мкг каждого из 10 олигонуклеотидов инкубируют при 37°С 15 мин в 20 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ

/1Сточника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной или нитратной форме, так и органические соединения - пептон, триптон, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды. Проявляют

устойчивость к тетрациклину при концентрации последнего не более 5-7 мг/л.

Продуктивность. Уровень синтеза ГР по данным иммуноферментного анализа составляет 50-60 мкг на мл ночной культуры.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМСР-325Д.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBCHtrp3.

А). Конструирование плазмиды syn/pBR327.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего N-концевую часть ГР КРС (аминокислоты 1-23), используют синтетические

олигонуклеотиды.

-) Hind III

V

трисНС, рН 7,5, 5 мМ MgCI., 5 мМ дитиотейтола (ДТТ), 5 mKCI Y - Р-АТР (800 С1/тМ), 4 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4. Затем добавляют 2 мкл 10 тМ раствора не30 меченного АТР и инкубируют еще 30 мин при 37°С, Инкубационные смеси объединяют, добавляют 50 ед. ДНК лигазы фага Т4 и инкубируют в течение 12 ч при 4°С. Смесь прогревают 10 мин при 70°С, добавляют

35 5 М раствор NaC до концентрации 0,1 тМ, 50,ед, рестриктазы EcoRI, 50 ед., рестриктазы Hind III и инкубируют при 37С 5 ч. Инкубационную смесь пропускают через КОЛОНКУ с Сефадексом G-50, фракционируют

40 электрофорезом в 8%-ном полиакриаламидном геле, вырезают из геля полосу, соответствующую фрагменту размером около

75 п.о., и элюируют ДНК из геля, ДНК после переосаждения спиртом растворяют з 120 мкл воды.

5 мкг плазмиды pBR327 гидролизуют рестриктазами EcoRI и Hind 111 в инкубационной смеси следующего состава: 50 Мтрис HCI, рН 7,5.10 тМ NaCl, 10 тМ MgCla, 1 тМ ДДТ, 10 ед, EcoRI и 10 ед. Hind HI в течение 2 ч при 37°С. Смесь фракционируюг в 1 %ном агарном геле и элюируют линейную форму плазмиды. используя легкоп.гавкую агарозу фирмы BRI. ДНК переосаждают спиртом и растворяют в 50 мкл воды.

Лигирование фрагмента ДНК и плазмиды проводят в смеси объемом 20 мкл, содержащей 1 мкл раствора фрагмента, 1 мкл раствора плазмиды, 20 тМ трисНС, рН 7,5, 10 тМ ДТТ,-10 тМ MgCi2, 1 тМ АТР, 5 ед. ДНК лигазы фаза Т4, при 4°С в течение 12 ч. К 12 мкл инкубационной смеси добавляют 48 мкл ТЕ-буфера (50 М трисНС, рН 8,0, 1 тМ ЭДТА). Раствором ДНК трансформируют клетки штамма E.coli НВ101. Отбирают клон.ы по устойчивости к антибиотикам. Вставку с нужной ориентацией определяют секвенированием. В результате отбирают плазмиду, обозначенную syn/r BR327.

Б. Конструирование плазмиды pBGHI190.

10 мкг ДНК плазмиды рЬ G Н18 гидролизуют в инкубационной смеси объемом 50 мкл 30 ед. рестиктазы EcoRI в течение 1,5 ч при 37°С, как описано ранее, ДНК из смеси осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде. Гидролиз линеаризованной плазмиды pBGH18 рестриктазой Pvu II прог водят в 100 мкл инкубационной смеси в среднесолевом буфере в течение 10 мин при 37°С. На 10 мкг ДНК берут 30 ед. фермента. Реакцию останавливают добавлением раствора ЭДТА до концентрации 20 тМ. Реакционную смесь экстрагируют равным объемом смеси фенол:хлороформ. ДНК из водной фазы осаждают спиртом, высушивают, растворяют в воде - фракционируют в 1% агарозном геле. Нужный фрагмент ДНК (Pvu II - EcoRI -фрагмент размером 680 п.о.) элюируют из легкоплавкой агарозы с помощью стандартной процедуры осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде.

0,5 мкг Pvu II - EcoRI -фрагмента инкубируют в 10 мкл сррднесолевого буфера с 5 ед. р стриктазы Hind III в течение 1 ч при 37°С. ДНК из реакционной смеси осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде.

Для получения вектора из плазмиды syn/pBR327 4 мкг ДНК гидролизуют в 20 мкл инкубационной смеси на основе среднесолевого буфера, содержащей 15 ед. Pvu II и 20 ед. Hind III, в течение 1,5 ч при

37°С. Реакционную смесь фракционируют в 1 %-ном агарозном геле и вектор элюируют,

5 используя легкоплавкую агарозу. ДН К осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде.

Лигирование Pvu II - Hind 111 - фрагмента к ДНК ГР КРС с Pvu II - Hind IU-век0 тором (syn/pBR327) осуществляют в 20 мкл инкубационной смеси следующего состава: 50 тМ трисНа, рН 7,6, 10 тМ MgCl2, 5 тМ ДДТ. 0,1 М спермидина, 0,05 тМ ЭДТА. 1 тМ ЛТР. Соотношение аектор:вставка

5 (моль) составляло 1:2. Реационную смесь инкубируют с 10 ед. ДНК лигазы фагаТ4 в течение ночи при 8°С. Лигазной смесью трансформируют клетки штамма Е.соИ НВ101. Плазмиды из полученных клонов анализируют с помощью гидролиза рестриктазами. Правильность структуры подтверждают секвенированием методом Максима-Гилберта. В результате отбирачрт плазмиду нужной структуры, обозначенной

pBGHl-190.

В. Конструирование плазмиды pBGHBa112.

Для удаления 3 -нетранслируемого участка кДНК ГР КРС 10 мкг плазмиды pBGHI0 190 гидролизуют рестриктазой Ват Н I в 20 мкл инкубационной смеси на основе среднесолевого буфера в течение 1 ч при 37°С. Линейную форму плазмиды обрабатывают нуклеазой Ва131. Далее проводят обработку полученных ДНК фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 в присутствии dNTP и прошивку синтетического Hind Illлинкера 5-CCAAGCTTGG-3. Смесь прогревают 5 мин при 70°С, добавляют 10 ед.

0 рестриктазы EcoRI и 30 ед. рестриктазы Hind III и инкубируют в течение 3ч при 37С. Смесь полученных фрагментов фракционируют в 1 %-ном агарозном геле и выделяют фрагменты длиной 580-650 п.о. После

5 переосаждения этанолом ДНК растворяют в 20 мкл воды. 5 мкг плазмиды pV CIS гидролируют рестриктазами EcoBI и Hind III. К 100 нг pV С18. расщепленной EcoRI и Hind 111, добавляют 5 мкл раствора фрагментов

0 ДНК, выделенных из агарозь, и проводят инкубацию с ДНК лигазой фага Т4. Лигазной смесью трансформируют штамм ТС1. Клетки высевают на индикаторные чашки с, X-gal и ИПТГ, содержащие ампициллин.

5 Проводят отбор белых колоний. Из полученных клонов выделяют плазмиды, определяют нуклеотидную последовательность З -концевой части кДНК ГР КРС методом Сэнгера, отбирают плазмиду, содержащую

0 EcoRI-Hind III - фрагмент с геном ГР КРС размером 601 п.о., обозначенную pBGHBa112.

Г. Конструирование плазмиды pBGHtrpl.

Плазммдную ДИК pSTH2191, содержащую trp-npoMOTOp, гид рол и ЗУ ют рестриктазами EcoRI и Hind III. Векторную ДНК выделяли из 1 %-ного агарозиого геля. Плазмидную ДНК pBGHBa112 гидро/шзуют рестриктазами EcoRi и Hind III и выделяют из агарозного геля фрагмент размером 601 ГКО., фрагмент и вектор обрабатывают ДНК лигазой фага Т4 в стандартных условиях. Лигазной смесью трансформируют клетки Е.соИ НВ101. Плазмиды из полученных клонов анализиру дт, гмдролизуя рестриктазами EcoRI и Hind ill. В результате отбирают плазмиду, обозначенная pBGHtrpl. Полученной плазмидой трансформируют штаммы Е.соШ К802 и DH1. Анализируют содержание ГР КРС в полученных штаммах методом мммуноферментного анализа и с помощью электрофореза белков з полиакриламидном геле с додецилсульфатог4 натрия. Наиболее высокий выход наблюдается Q случае штамма DHI/pBGHtrpi, однако он быстро снижается при храменми культуры.

Д. Конструирование плазммды рВОИ /рЗ.

Г|лаз.мядну 0 ДНК pOGHtrpll гидролизуют последовательнд рестриктазами EcoRi и Smal. Быделяют-векторную ДНК фракциoниposaниe , с помощью электрофореза в 1%-iiOM агррозном re/ie. Плазмидную ДНК pBGHtrpl также гидролмзуют, рестриктазами Угла и выделяют фрагмент размером 427 п.о. Проводят ciij-шку фрагмента и вектора Д1-|К лигязпй фага Т4 и трансформацию клето.с штамг.Э Е.соП DH лигазной смесью. Отбирают клоны, синтезирующие ГР КРС. Пр; ги4льность структуры плазМИДЫ подтверждают секвенирозаниег.1 вставки. В результате отбирают плазмиду, обозначенную pBGHtrpS.

Г р и мер 2, Получение илаима E.coli DHI - продуцента ГР КРС,

Плазмидой pBGHtrp3 трансформируют штамм Е.со .DHi по/гучают штамм продуцент ГР КРС.

Штамм выращивают в течение ночи в 3 мл среды УТ (5 г/л) бактотриптома, 8 г/п дрожжевого экстракт... 5 г/л NaC, 25 мг/л ампициллина). Кпегкл осаждают центрифугироаанием и суспендируют в 100 мл буфера, содержащего 100 гпМ трисНС(, рН 8,0, 1 fiM ЭДТА м 1% SDS. Суспензи:о прогреваЮ; в течение 10 мим иа кипящей водяной ба .е, охлаждают до (o 4иaтнoй температуры и центрифугируют. Отбирают 10 мкл супернатанта, добавляют 10 мкл буфера, содержащего 20% глицерина, 0% -меркаптоэтанола. 0,2 М трисНС, рН 7,0, 8% SDS, 0,025% бромфенолового синего. Образец прогревают 5 мин при 100°С и подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Гель сканировали на лазерном динситометре. Содержание ГР КРС в клетках штамма достигает 20-25% от суммарного белка клеток.

Содержание гормона в биомассе штамма определяют путем лизиса бактерий и измерения гормона в лизате методом иммуноферментного анализа. Накопление ГР КРС в биомассе достигает 50-60 мг на 1 л ночной культуры.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBGHtrp 3, кодирующая гормон роста крупь:ого рогатого скота, размером 6,9 т.п.о., содержащая:

EcoRI - Hind III - фрагмент плазмиды р5„ ТН2191 размером 5300 п.о.;

EcoRI - Hind in -фрагмент ДНК плазмиды pBGH18. кодирующий гормон роста крупного рогатого скота, размером 601 п.о.;

Hind И - фрагмент ДНК плазмиды pOGH trpll, включающий 153-злемент, размером 916 п.о.;

один участок расщепления рестриктазы EcoRI: .

один участок расщепления рестриктззы Srnal, расположенный на расстоянии 427 п.о. от EcoRi-сайта;

три участка расщепления рестриктззы Pst, расположенные на расстоянии 300, 1353 и 5095 п.о. от EcoRI-сайта;

даа участка расщепления рестриктазы Hind 111, расположенные на расстоянии 601 Г.о. и 1517 п.о. от EcoRI-сайта:

один.участок расщепления рестриктазы EcoRV, расположенный на расстоянии 1673 п.о. от EcoRI-сайта;

один участок расщепления рестриктазы 8amHI, расположенный на расстоянии 1863 п.о. от EcoRi-сайта:

один участок расщепления рестриктазы SalGl, расположенный на расстоянии 2138 п.о. от EcoRI-сайта:

один участок расщепления рестриктазы ilpal, расположенный на расстоянии 6784 п.о. от EcoRI-сайта: Z -- генетические маркеры:

Ыа-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от до 2100 п.о. против часовой стрелки от Нра -сайта:

тег-ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, расположенный в участке от 1500 до 2500 п.о, по часовой стрелке от EcoRI-сайта:

9170884710

перед последовательностью, кодирующей2. Штамм бактерий Escherlchlacoll ВКМ гормон роста крупного рогатого скота, рае-СН325Д - продуцент гормона роста крупноположена промоторная область триптофа-го рогатого скота. нового оперона.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Сконструирована плазмидная ДНК pBGHtrp3, содержащая ген, кодирующий гормон роста крупного рогатого скота (ГР КРС), находящийся под контролем промотора trp-оперона Е.соМ, и фрагмент бактериального 153-элемента, расположенный после гена ГР КРС. Штамм-продуцент получен траснформацией плазмидой pBGHtrp3 штамма Б.соИ ДН1. Наличие в плазмиде фрагмента 133-злемента стабилизирует продуктивность штамма-продуцента и позволяет достичь высокого уровня синтеза целевого продукта, не прп/1бегая к индукции, не менее 50-60 мкг/мл культуры. 2 с.п. ф-лы.•^•^Ё