Рекомбинантная плазмидная ДНК pGA9, кодирующая синтез белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа, способ ее конструирования , и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа Советский патент 1992 года по МПК C12N15/48 C12N15/70 

Изобретение отно.сится к медицине и биотехнологии.

Известна рекомбинантнэя плазмидная ДНК pG7T, содержащая фрагмент гена gag, кодирующий белок р24, и обеспечивающая синтез в бактериях Е.соИ гибридного белка, N - концевая часть которого представлена полноразмёрной бета-галактозидазой, а Сконец - вирусспецифической аминокислотной последовательностью.

Основным недостатком pG71 является ее нестабильность в клетках E.coli, вследствие этого при культивировании штамма несущего плазмиду pG71 в среде без

использования антибиотика ампициллина, использование которого экономически неоправдано, большая часть клеток теряет плазмиду, а также способность продуцировать гибридный белок, что приводит к резкому снижению выхода конечного продукта.

Известна рекомбинантная плазмида, детермини|эующая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1.

Однако даже в присутствии селективного маркера отмечается высокий уровень нестабильности данной конструкции в клетках бактерий E.coli, что приводит к существенному уменьшению выхода конечного продукта - рекомбинантного белка, содержащего вирусспецифические последовательности,

Цель изобретения - повышение уровня синтеза целевого продукта. ,

Для этого из плазмиды рАК2В выделяют EcoRl - фрагмент ДНК, содержащий ген устойчивости к канамициму и раг-участок, определяющий стабильное наследование плазмид Со1Е1-типа, и вводят в состав плазмиды pG30. Полученную плазмиду вводят с штамм Е.соИ НВ101 с помощью трансформации. Таким образом получают искомый штамм НВ101 pGA9, содержащий стабильно наследуемую плазмиду, обеспечивающую высокий уровень синтеза гибридного белка, N-концевая часть которого представлена полноразмерной бета-галактозидазой. а С-конец - вирусспецифической последовательностью продукта гена gag, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1.

Плазмида имеет размер 7,9 т.п.н., состоит из EcoR1 -фрагмента плазмиды рСЗО размером 6,15 т.п.н. с геном бета-лактомазы, гибридным, геном бета-галактозидаза областью ог1 и 5coR1 - фрагмента плазмиды рК25, размером 1,45 т,п.и., содержащего ген устойчивости к канамицину и par-участок ColA, уникальные сайты рестрикции BamH1,Sal1.

Плазмида определяет устойчивость клеток E.coli -)В101.к ампициллину и канамицину и синтез в них гибридного белка с вирусспецифическими последовательностями. Плазмида иеконьюгативна.

Штамм характеризуется следующими признаками,

Морфологичэские признаки, lOieTKS-i прямые палочковидной формы 1,2х 1,6x2,0 мкм подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспсроойразующие,

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питатель ibix средах, При росте на мясо-пептон ном агаре колонии гладкие круглые прижаты блестящие серые край ровный мутные,

При росте на жидких средах; нясо-пептонном бульоне, Ьбульоие образуют ровную интенсивную муть,

Физико-биохимическме признаки, Клетки растут в пределах от 4 до при оптимуме рН от 6,8 до 7,5, В качестве источника углерода используют глюкозу, фруктозу. Не усваивают ацетат. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол на образуют, Уреззиая активность не обнаруживается.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки устойчивы к ампициллину и канамицину,

П р и м е р 1, Конструирование плазмиды pGA9,

Фрагмент ДНК, содержащий ген устойчивости к канамицину, и par-участок ColA выделяют из плазмиды рАК25, Для этого рАК25 подвергают гидролизу рестриктазой E,coR1, инкубируя 20 мкг ДН К рАК25 с 20ед.

0 фермента в присутствии 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCIa 10 мМ трис-НС, рН 7,5, 1 мМ ДТТ в течение 2 ч гфи 37°С с последующим прогреванием при 75°С в течение 15 мин. Далее гидролизованную ДНК разделяют в 0,8%

5 агарозном геле и выделяют нужный фрагмент ДНК, используя бумагу ДЕ 81.

В качестве вектора используют плазмиАУ рОЗО, полученную следующим образом, Клетки бактерий E.coli НВ101, содержащие плазмидную ДНК pUR290 выращивают в 200 мл бульона до титра 1 х 10 клеток/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5 000 д, 6 мин, 4°С) и ресуспендируют в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона Х-100, 50 мМ ЭДТА, рН 8,0 м 10 мМ трис-НС1, рН 8,0, Далее добавляют 2,5 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/мл быстро перемашивают и нагревают на кипящей водяной 5с че в течение 3 мин, Полученный лизат центрифугируют (20 000 д, 30 мин 4°С) и ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием

5 (12000 g 20мин, 2°С) и ресуспендируют в 5 мл 10 мМ трис-НС1 (рН 8,0) буфера. Окончательную очистку плазмидной ДНК проводят методом равно&естного центрифугирования в градиенте плотности CsCI с

0 бромистым этидием,

1 мкг ДНК плазмиды pUR290 инкубируют с эндонулеазой рестрикции Hind III (10 единиц) в буфере, содержащем 50 мМ трисНС, рН 8,0; 50 мМ NaCI, 10 мМ MgClz, 1 мМ

5 2-меркаптоэтанола, Реакцию проводят 1 ч при 37°С, Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза,

.Препарат индивидуального Hind III фрагмента генома ВИЧ 1 размером 627 н,п,

0 с координатами 631-1258 н,п, выделяют из смеси Hind П фрагментов ДНК плазмиды pG71. Выделение индивидуального фрагмента осуществляют методом электрозлюции из 1,5% агарозного геля.

5 Соединение смеси фрагментов ДНК плазмиды pUR290 (0,5 мкг) и Hind ill фрагментов ВИЧ 1 из плазмиды pG71 проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 еди 1иц/мл) из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг ДНК в течение 10 ч при ,

Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток Е.соИ НВ101. Трансформацию проводят следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток E.coli НВ101 вносят 8 20 мл питательного L-бульона и выращивают до титра 3x10 клетокмл. Клетки собирают центрифугированием (5 000 g 10 мин 0°С), суспендируют в 10 мл 75 мМ раствора CaCl2 и выдерживают 30 мин при 0°С. Клетки повторно центрифугируют (5000 g 10 мин 4°С), затем ресуспендируют в 1 мл 75 мМ CaCl2 () и 1UO мкл такой суспензии используют для трансформации. Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компетентными клетками (обработанными CaCl2) в течение 1 ч при 0°С и 3 мин при 42°С. После двадцатикратного разбавления L-бульоном трансформированные клетки подращивают 1,5 ч и высевают на агаризованну.о среду L-бульона с ампициллином (30 мкг/мл). Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 36 ч при 37°С, анализируют с помощью чЭлектрофореза. Отбирают плазмидную ДНК большей чем векторная плазмида молекулярной массы и анализируют ее с помощью фермента Hind 111. Рекомбинаитную плазмиду, содержащую удвоенный Hind III фрагмент области gag ВИЧ 1 в пркмой ориентации называют рСЗО. 1 мкг ДНК pG30 подвергают неполному гидролизу рестриктазой EcoRI в течение 20 мин при 37°С в инкубационной среде, указанной выше.

К 0,2 мкг ДНК рСЗО. обработанной рестриктазой, добавляют 2 мкг EcoRiфрагмента рАК25, содержащего ген устойчивости к канамицину, и par-участок , 50 единиц, ДНК-лигазы и инкубируют смесь 16ч при 12°С в присутствии 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCl2, 10 мМ трис-НС1, рН 7,5; 1 мМ ДТТ,5мМ АТФ. Конечный объем смеси составляет 10 мкл.

К лигированному препарату ДНК добавляют 100 мкл компетенных клеток E.coli НВ101 и инкубируют, кгк описано выше, после чего клетки разводят в 20 раз Lбульоном и инкубируют с аэрацией 1 ч при 37°С. Клетки высевают на чашки Петри с 1,5%-ным L-arapoM, содержащим 100мкг/мл ампициллина и канамицина. Из трансформантов выделяют плазмидную ДНК и используют ее для рестрикционного анализа.

Рестрикционный анализ плазмидной ДНК показывает наличие в них фрагментов, соответствующих E.coRI-фрагменту рАК25 и рСЗО.

Для окончательного выбора нужной плазмиды проводят анализ способности выбранных плазмид синтезировать гибридные белки молекулярной массы 165 кД. содержащие вирусспецифические последовательности области gag.

П р и м е р 2. Определение уровня синтеза гибридного белка.

. 2 мл суспензии клеток Е.соИ ИВ 101, содержащих плазмиду pGA9, выросших в течение ночи из отдельной колонии до концентрации 2x10 клеток/мл в Ьбульоне,,

содержащем 30 мкг/м л ампициллина и 100 мкг/мл канамицина, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 7,8; 2,5% дсдецилсульфата натрия, 10% глицерина, 0,7% меркантоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кипятят 5 мин на водяной бане и 20 мкл анализируют методом электрофореза. Лизаты бактерий, содержащих плазмиду

pGA9, содержат дополнительный белок с мол ,м. 165 кД. Антигенную активность этого белка определяют с помощью метода иммуноблотинга. Полученный гибридный белок обладает антигенной активностью ВИЧ 1.

Уровень синтеза гибридного белка составляет не менее 20% от тотального клеточного белка, т.е. 1 л клеточной суспензии позволяет получить 650-750 мг белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1.

Синтезируемый белок представляет собой гибридный полипептид, состоящий из 1452 ар инокислотных остатков (ак), представленных 1023 ак бета-галактозидазы, В ак, кодируемых полилинкерной последовательностью векторной плазмиды

pUR290, 418.ак кодируемых фрагментов

ВИЧ 1 и 3 ак кодируемых полилинкерной

последовательностью вектора pUR290.

Таким образом, изобретение позволяет

повысить уровень синтеза целевого продукта за счет того, что все клетки в популяции содержат плазмиду, а также снизить себестоимость продукта, так как отпадает необходимость использования антибиотика для

стабилизации плазмиды при выращивании штамма-продуцента.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pGA9, кодирующая синтез белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа. размером 7,9 т.п.н., содержащая EcoRI EcoRI - фрагмент плазмиды pG30 размером

6,45 Т.П.Н.; EcoRI - EcoRI - фрагмент плазмиды рАК25 размером 1,45 т.п.н.: уникальные сайты рестрикции BamHI, Sail; генетические маркеры; Ар - ген устойчивости к ампициллину; Km - ген устойчивости к канамицину; gag-ген, обеспечивающий син7 17088488

тез гибридного белка размером 1452 ак. со-участок Со1 А. лигируют его с ДНК плазмиды

стоящего из 1023 ак бета-галактозидазы, 8pG30, полученной путем гидролиза EcoRI,

ак, кодируемых полилинкерной последова-лигазной смесью трансформируют клетки

тельностью векторной плазмиды pUR290.Е.coll НВ101, с помощью рестрикционного

418 ак, кодируемых фрагментами гена gag5 анализа и анализа способности определять

ВИЧ 1 и 3 ак, кодируемых полилинкеромсинтез целевого продукта отбирают клоны,

PUR290.несущие плазмиду pGA9.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pGA9, заключаю-З.Штамм бактерий Escherlchia coll ГКВ

щийся в том, что выделяют EcoRl-EcoRI -10 pGA9-gag - продуцент белка, обладающего

фрагмент ДНК плазмиды рАК25, содержа-антигенными свойствами вируса иммкунощий ген устойчивости к канамицину и par-дефицита человека первого типа.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Цель изобретения состоит в повышении выхода целевого продукта. В плазмиду pG30 введен EcoW-ЕсоЖ-фраг- мент ДНК плазмиды рАК25, содержащий раг-локус, обеспечивающий стабильное наследование гибридной плазмиды pGA9, которая имеет размер 7,9 т.п.н. Плазмида pGAQ имеет уникальные сайты рестрикции: BamHI, Sail, определяет устойчивость к ампициллину и канамицину, неконьюгативна, кодирует синтез белка, обладающего .антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа ( ВИЧ 1). Плазмиду- pGA9 вводят в штамм Е.соИ НВ101 с помощью транс«|>&ормации, получают штамм, обеспечивающий синтез белка в количестве 650-750 мкг/мл белка, N-конце- вая часть которого представлена полноразмерной бета-галактозидазой, а С-конец - Бирусспецифической последовательностью продукта гена gag, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1. 3 с.п.ф-лы.(Лс