ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ НА ε -КАПРОЛАКТАМ И/ИЛИ e -АМИНОКАПРОНОВУЮ КИСЛОТУ Советский патент 1995 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к очистке сточных вод химической промышленности, и касается нового штамма микроорганизмов, который может быть использован в качестве тест-культуры на ε-капролактам и ε-аминокапроновую кислоту.

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего способностью разлагать ε-капролактам и/или ε-аминокапроновую кислоту, но не адипиновую кислоту.

Штамм Pseudomonas putida BS 864 выделен методом накопительной культуры из очистных сооружений производства ε-капролактама, депонирован под номером ВКМ CR299D.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Колонии на агаризованной среде округлой формы с ровными краями, 1-2 мм диаметром, S-формы, бесцветные с обеих сторон. Клетки палочковидные 2,5-3,3 х 0,7-1,2 мкм, подвижные. Полярный лофотрих, грациликутный тип клеточной стенки, характерно бинарное деление, отсутствие кислотоустойчивости, специфических включений и газовых вакуолей. Образует желто-зеленый флуоресцирующий пигмент на стандартной среде Кинга и МПА. Среды для выращивания: мясо-пептонный бульон (агар), синтетическая среда с ε-капролактамом, глюкозой или другими источниками углерода.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб, растет при t^о≅37^оС, оптимум 30-35^оС. Оптимум рН 7,0-7,5 рост в пределах рН 5,0-9,0. При длительном росте на питательной среде наблюдается ее подщелачивание. Нитраты редуцирует, желатину не разжижает. Характерные запахи не обнаружены.

Обладает оксидазной активностью. Разлагает ε-капролактам и ε-аминокапроновую кислоту при их концентрации от 0,2 до 5000 мг/л.

При выращивании в жидкой среде с ε-капролактамом разлагает его на нетоксичные компоненты. Непатогенен.

Генетические признаки.

Штамм содержит трансмиссибельную плазмиду рВS 282 размером порядка 200 килобаз.

Условия хранения штамма.

Штамм хранится в лиофилизованном состоянии, защитная среда молоко. При этом свойства штамма устойчивы.

Примеры конкретного применения штамма.

П р и м е р 1. Культуру Pseudomonas putida BS 864 выращивают в МПБ в течение суток, 1 мл культуры вносят в колбы емкостью 750 мл с 100-200 мл среды следующего состава:
1. 0,05 М К-фосфатный буфер рН 7,0 с NH₄NO₃ 1 мг/л
2. FeSO₄˙7H₂O 1 мг/л
3. Микроэлементы: CuSO₄˙7H₂O 2мг/л Н₃ВО₃˙Н₂О 0,06 мг/л MnSO₄˙Н₂О 0,3 мг/л ZnSO₄˙Н₂О 20 мг/л Na₂MoO₄˙2Н₂O 3 мг/л CaCl₂˙6H₂O 10 мг/л NiCl₂˙6H₂O 0,5 мг/л MgSO₄˙7H₂O 50 мг/л 4. ε-капролактам 4 г/л
Все 4 компонента среды стерилизуют отдельно при 0,5 атм, 30 мин.

Культуру выращивают на качалке при 200 об/мин при 30-35^оС. Через сутки в культуральной жидкости остается 5% капролактама. Его количественный анализ проводят методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе "Хром-4" (ЧССР). В качестве внутреннего стандарта используют N-метил-2-пирролидон. Колонка 100 х 3 мм с сорбентом 4-ФФ-938. Температура 160^оС. Скорость потоков (см/мин) аргона 50, водорода 50, воздуха 500.

П р и м е р 2. Культуру P.putida BS 864 выращивают на МПБ в течение суток, вносят в пробирки с 5 мл среды с различными источниками углерода: глюкозой, ε-капролактамом, ε-аминокапроновой кислотой и адипиновой кислотой. Культуру выращивают на качалке 200 об/мин, при 30^оС. Через 18 ч определяют оптическую плотность (КФК-2, кювета 5 мм, 590 нм).

Эффективность утилизации штаммом различных источников углерода.

Появление мутантов с указанной частотой не придает в данных условиях популяции клеток штамма В 864 свойств тестерного штамма на адипиновую кислоту и сохраняет тем самым его специфичность в отношении капролактама.

П р и м е р 3. Культуру бактерий P.putida BS 864 выращивают на МПА (мясо-пептонном агаре) в виде отдельных колоний при 30^оС в течение суток. Затем стерильными палочками переносят отдельные колонии в лунки стерильных планшетов, в которые предварительно вносят по 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Колонии ресуспендируют, после чего полученные суспензии наносят с помощью репликатора на поверхности агаризованных синтетических сред (см. пример 1), содержащих в качестве единственных источников углерода ε-капролактам, ε-аминокапроновую или адипиновую кислоты в концентрациях 1,5 мг/мл, глюкозу 20 г/л, отпечатки инкубируют 48 ч при 30^оС.

Таким образом, штамм Р. putida BS 864 обладает способностью разлагать ε-капролактам и ε-аминокапроновую кислоту, но не утилизирует адипиновую кислоту, что обеспечивает возможность его использования как биосенсора на эти соединения. По способности разлагать ε-капролактам штамма P.putida BS 864 не уступает другим штаммам-деструкторам этого соединения и может применяться при очистке промышленных сточных вод от ε-капролактама и ε-аминокапроновой кислоты.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к процессам очистки сточных вод химической промышленности и касается нового штамма микроорганизмов, который может быть использован в качестве тест-культуры на e капролактам и e аминокапроновую кислоту. Штамм Pseudomonas putlda BS 864, обладает способностью разлагать e капролактам и e аминокапроновую кислоту, но не утилизирует адипиновую кислоту, что создает возможность для его использования в качестве биосенсора на эти соединения. Штамм может применяться при очистке сточных вод от e капролактама или e аминокапроновой кислоты. Пределы концентраций, e капролактама и e аминокапроновой кислоты, при которых штамм эффективно функционирует как деструктор - от 02 до 5000 мг/л, штамм выделен из сточных вод производства e капролактама. 2 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ CR 229D, используемый в качестве тест-культуры на e капролактам и/или e аминокапроновую кислоту.