Способ анализа смеси веществ Советский патент 1992 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к биохимии; и биотехнологии, в частности к способам биохимического анализа вещества.

Известен способ, заключающийся в том, что подготавливают разделяющую среду, например полиакрилзмидный гель, наносят образец, через электродный буфер и электроды подают напряженней по истечении определенного времени извлекают гель,.фиксируют и окрашивают его, по количеству и расположению зон судят о компо ; нентном составе образца. У;

Однако способ трудоемок и требует зна- -. чительных затрат времени на его осущёс в-л ление. ;

Известен способ анализа веществ путем накладывания импульсного пилообразного напряжения с плавным нарастанием крутизны переднего фронта и резким спадом заднего фронта, причем нарастание напряжения осуществляют от базового постоянного напряжения 40-600 В.,,. :;

Однако данный способ требует для своего осуществления больших затрат времени -от 1,5до 6ч.

Цель изобретения - повышение экс- прессности анализа.

Поставленная цель достигается тем, что измеряют вольт-амперную характеристику в интервале потенциалов от 0 до 400 В и по ве л-ичине потенциала полуволн вопьт-ам- перной характеристики идентифицируют компоненты смеси, а по величине амплитуды тока определяют их количество.

На фиг. 1 представлена зависимость подвижности лактатдегйдрогеназы от концентрации геля; на фиг. 2 - зависимость подвижности гемоглобина от напряжения в 7,5%-ном полиакриламидном геле; на фиг. 3 - вольтгамперная кривая образца из трех компонентов.,

П р и м е.р 1 Для реализации способа сконструирована специальная установка, включающая систему термостатирования H3MepHTeflfbHbix ячеек на базе ультрэцермо- стата-5. точность термостатирования +0.1°С.

И

О О CJ

Измерительные ячейки представлены стеклянной трубкой, плавно переходящей в рас- ширенную емкость для электродного буфера с впаянным электродом..В трубке формируется гель и верхняя часть ячейки вводится нижним торцом трубки во вторую (нижняя часть) в виде стакана с электродным буфером и вторым электродом. Измерительная ячейка размещалась внутри металлического заземленного холодильника (термостата), который одновременно служил экраном от электрических помех. Ячейка подключалась в мост, причем в левой части моста ячейка и сопротивление 5 кОм, в правой - магазин сопротивлений и сопротивление 5 кОм. В диагонали моста в качестве нуль-индикатора измеритель тока Р341 с пределом измерения-тока . А с самописцем Endim, в другой диагонали - источник изменяющегося напряжения с шагом 1 мВ от базы 0-400 В.

Для реализации способа, плавного изменения напряжения от заданной базы применяли специально сконструированный для этих целей делитель напряжения., включающий электродвигатель РД-09,.редуктор, соединительную муфту, многооборотный потенциометр 1 кОм,. вилку переключения передач редуктора. В качестве источника напряжения применяли стабилизированный источник напряжения Б5-50. Применя- ли гель полиакриламидный 7,5%. Химический состав геля, и электродного буфера стандартные. Образец, в состав которого входили гемоглобин 20 мкг, фиброноген 10 мкг. альбумин 10 мкг (объем образца 250 мкл с 30%-ной сахарозой), наносили под электродный буфер на поверхность геля. С помощью магазина сопротивлений уравновешивали мост., включали начало повышения напряжения. Разбаланс моста за счет начала электрофо- ретического движения-компонентов и падения сопротивления фиксировался в виде волны тока (фиг. 3).

Как видно из диаграммы, наблюдаются три волны, отличающиеся по потенциалу прлуволны, а отношение амплитуд 2:1:1. Если альбумин считать маркером с известной концентрацией, т.е, 10 мкг, то концентрация фибриногена соответствует 10 мкг, гемоглобина - 20 мкг. В других сериях проводились исследования изоферментного состава препаратов а. -амилазы и пероксидазы, Изо- ферменты этих препаратов, трудно идентифицировать, так как они отличаются один от другого по молекулярной массе на 5 кД. Исследовайие а -амилазы показано 10 очень хорошо различимых волм - -0;, сги

20-35 В с соотношением амплитуд 5, 6, 4,3, 7, 8, ,9, 1, 2, 3- Идентификация с помощью изоэлектрофокусирования такж ,оказала 10 зон проявления на ферментную лхтивность крахмал-йодным методом. Испедо- вание изоформ, состава пероксидазы показало наличие 7 волн в области 30-60 В с соотношением амплитуд 7, 8, б, 9, 2, 3, 4, Проявление зон, разделенных изоэлектрофокусированием, показало также 7 зон. Таким образом, предложенный способ исследования смеси веществ реализуется с хорошей разрешающей способностью. П р и м ер 2. Для сравнения, способов

применяли импульсный электрофорез е импульсами специальной формы и предлагаемый способ. По известному способу полиакриламидный гель 7,5%, напряжение базовое 60 В, импульсы до 200 В, ток 5 мА

на трубку,фиксация геля в 10% ТХУ.ссуль- фациловой кислотой, окраска по Вестербер- ry R-250, образец составлен следующим образом: фибриноген, гемоглобин, альбумин. Хронометрия способа с точностью 1 с

представлена в таблице.

ПримерЗ. Обоснование указанного интервала потенциалов..Величина интервала и базовое напряжение лимитируются соотношением сигнал-шум и термическими

эффектами ионной проводимости. Так, при небольших значениях полезного сигнала, определяемого потенциальным барьером междефектного перехода в периодической коллоидной структуре, но при большом

межэлекТродном сопротивлении соотношение сигнал/шум может быть 1:500 и более. . а это существенно сказывается на точности измерения и разрешающей способности. С другой стороны, при высоких напряжениях

существенно сказывается термический эффект, что уменьшает величину полезного сигнала и разрушает периодическую коллоидную структуру разделяющей среды.

Необходимо отметить, что указанный

интервал напряжения применим для гелей агарозного и полиакриламидного. В качестве примера проводилось измерение волны тока каталазы при различных концентрациях геля, достигающих 40%, и соответственно

повышения межэлектродного сопротивления и базового напряжения. Установлено, что величина сигнала волны тока графически представляет собой кривую с максимумом при базовом напряжении 85 В, далее с ростом

напряжения (ростом концентрации геля) величина сигнала падает до неразличимой при базовом напряжении 400 В.

Таким образом, величина 400 В является предельной для базового напряжения в исследованиях с агарозным и полиакриламид- ным гелем.

Предлагаемый способ позволяет на 4 - 5 минГ. получить качественный и количественный анализ компонентного состава образца. Кроме того, используя прием последовательного электрофореза по потенциалам полуволны, способ позволит разделять и эллюировать их с высокой степенью чистоты и скорости.

Ф о р м у л а и з об р ете н и я Способ анализа смеси веществ, включающий нанесение образца на разделяющую

0

гелеобразную среду, наложение электрического в интервале потенциалов 40-400 В поля на образец с последующей идентификацией компонентов, о т л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения экспрессности анализа, снимают вольт-амперную характеристику в интервале потенциалов от 0 до 40,0 В и по величине потенциала полуволны вольт-амперной характеристики идентифицируют компоненты смеси, а по величине амплитуды тока определяют их количество.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам биохимического анализа вещества. Целью изобретения является повышение экспрессное™ анализа; Цель достигается тем, что образец с разделяющей средой включают в измерительную электрическую цепь, плавно увеличивают напряжение от О до 400 В и измеряют величину тока по потенциалу полуволны. По изменению вольт- амперной характеристики идентифицируют компоненты, а по амплитуде определяют их количество. 3 ил., 1 табл.

О 2 46 8 10 Щ М 76 18 20 22 2h С%

Шиг.1

V 200/50100 -

О 10 20 JO НО 50 60 108Q9Q1Q0110120E(8)

Фиг.2

20 30

Л

60

Е(В)

Фиг.З