Способ выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле Советский патент 1991 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, и касается способа выявления белков при изоэлектрофокусировании в борат-поли ольной системе в полиакриламидном геле.

Целью изобретения является опреде ление изоэлектрической точки белков низкомолекулярных пептидов.

Пример 1. Химотрипсинолиз бычьего сывороточного альбумина проводят по следующей методике: 100 мкг белка растворяли 100 мкл дистиллированной воды и по каплям добавляли 100 мкл 0,2 М N-метил-ацетатного буфера до рН 8,1. После этого добавляют 2 мкг химотрипсина, растворив его предварительно в 2 мкл дистиллированной воды. Пробирку закрывают пара- фильмом и перемешивают при 37°С в течение 4ч. После окончания химотрипI

синолиза на концентраторе фирмы Ami- con с фильтром рМ-10 из пептидной смеси отделяют фракции пептидов с мол.в. менее 10000 Д.

Стеклянные трубки с внутренним диаметром 4 мм и длиной 17 см помещают в виде пакета в химический стакан. Непрерывный линейный градиент рН создавали путем смешивания с помощью градиентного смесителя Ultro- grad (LKB Швеция) в определенных концентрациях трис-боратного буфера рН 7,0, содержащего борную кислоту 0,1 II (трис-Гидроксиметил), метиламин 0,039 М, мочевину 6 М, смесь акрил-бис/акриламид (30-1,2) 5% и 55% раствора глицерина в этом же буфере, после чего его рН снижалось до 4,0. Проводят подслаивание перисталь-: тическим насосом буферной смеси, начинал с самой щелочной, в химический

ел с

Од

1 1 ел

со со

стакан. Заполнение проводят в термостате при Т 25°С с последующей фотополимеризацией в течение 4 ч при Т 20°С под действием 0,15% рибофлавина и 0,038% тетраметиленэтилендиа- мида.

Изоэлектрофокусирование с целью определения количества пептидов после химотрипсииолиза бычьего сывороточного альбумина проводят в течение 26 ч. На щелочной торец столбика геля наносят 100 мкл пептидной смеси с мол.в. менее 10000 Д. Стеклянные трубки со столбиками геля подключают к источнику постоянного тока при градиенте потенциала 30 В/см. После окончания изоэлектрофокусирования гели извлекают из трубок с помощью вакуумного насоса и окрашивают в одном случае 0,1%-ным раствором кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 50%-ном этаноле и 10%-ной уксусной кислоте в течение 4 ч при Т 20°С с отмыванием в 6%-ной уксусной кислоте в течение 4 ч при Т 20°С с отмыванием в 6%-ной уксусной кислоте, в другом случае - 0,1%-ным раствором кумасси бриллиановый голубой R-250 в 25%-ном метаноле и 5%-ном глутаровом альдегиде в течение 4 ч при Т 20 С с отмыванием в 25%-ном метаноле и 0,4%-ном глутановом альдегиде.

На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляется полоса сфокусированных пептидов, отсутствующая в известном способе (фиг. 1 а, б).

Пример 2. Изофокусирование пептидов после химотрипсинолиза аль- долазы с последующим отделением на фильтре РМ-10 фракции пептидов с мол.м. менее 10000 Д проводят в тех же условиях, что и в примере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу глутаровый альдегид в концентрации 7%, а в отмывающем растворе - 0,3%.

На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляются две полосы сфокусированных пептидов при полном отсутствии полос в известном способе определения (фиг. 2 а, б) .

Пример 3. Изофокусирование пептидов после химотрипсинолиза ката- лазы с последующим отделением на фильтре РМ-10 фракции пептидов с мол .в. менее 10000 Д проводят в тех

же условиях, что и в примере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу глутаровый альдегид в концентрации 3%, а в отмывающем растворе - 0,3%.

На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляются три полосы сфокусироQ ванных пептидов при полном отсутствии полос в геле по известному способу определения (фиг. За, б).

Пример 4. Изофокусирование с целью определения количества пепти5 дов после химотрипсинолиэа бычьего сывороточного альбумина с последующим отделением на фильтре РМ 10 фракции пептидов с мол.в. менее 10000 Д проводили в тех же условиях, что в приQ мере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу 0,15%-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 20%-ном метаноле и 5%-ном глутаровом альдегиде (фиг. 4а) и

5 0,15%-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 30%-ном метаноле и 5%-ном глутаровом альдегиде (фиг. 4б).

На основании сканирования на лазерном денситометре гелей показано, что использование в фиксирующем красителе 0,15%-ного раствора кумасси бриллиантовый голубой R-250 и 20 и 30%-ного метанола не ведет к изменению пенситограмм.

5в результате проделанной работы

показано, что по сравнению с базовым методом получены лучшие результаты для определения изоэлектрических точек пептидов с мол.в. менее 10000 Д.

0 По сравнению с другими методами изо- электрофоретического разделения, такими как изоэлектрофокусирование в амфолитах различных фирм (алфолины фирмы LKB Швеция, сервалиты фирмы

5 Serva ФРГ, биолиты фирмы BioRad США), предложенный способ дает существенные преимущества для определения низ- комолекулярных пептидов. Амфолиты любой фирмы близки по мол.м. и химичес0 ким свойствам к низкомолекулярным пептидам и окрашиваются вместе с ними. Поэтому определение низкомолекулярных пептидов при разделении их в амфолитах невозможно.

Предлагаемый способ позволяет определить изоэлектрические точки пептидов, в то время как прототип изоэлектрические точки пептидов с

0

516

мол.в. менее 10000 не представляется возможным определить вообще (см. таблицу).

Значения иэоэлектрических точек пептидов, определенных в примерах, приведены в таблице.

Формула изобретения

Способ выявления пептидов при изо- электрофокусировании в полиакриламид- (ном геле путем фиксации геля, окраши

вания красителем кумасси бриллиантовым голубым R-250 и его отмывания, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности при определении изоэлектрической точки белков с мол.м. ниже 10000, фиксацию и окрашивание геля проводят одновременно 0,1-0,15%-ным раствором красителя в 20-30%-ном метаноле, содержащем 3-7% глутарового альдегида и 0,3- 0,5% его в отмывающем растворе.

Изобретение относится к биохимии и касается способа выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле. Целью является повышение чувствительности при определении изоэлектрической точки пептидов с мол.м. ниже 10000. Способ осуществляется изоэлектрофокусированием пептидов в борат-полиольной системе в полиакриламидном геле, фиксацией и окрашиванием гелей в 0,1-0,15%-ном растворе бриллиантового голубого в 20-30%-ном метаноле, содержащем 3-7% глутарового альдегида и обесцвечивают в 0,3-0,5%-ном растворе глутараль- дегида в 20-30%-ном метаноле. 4 шт., 1 табл. Q $

Фигура

Т

Значения

а

7,0

изоэлектрических точек

6,0

5,0

4,0

РИ

7,0

7,0

&F

Фиг.2

6,0

7,0

6,0

Фиг.З

5,0

- рН

W

5,0

-I рН W

5,0

W

+-рН

5,0

ч,о

рн

а

7,0

70

60

Ри

5,0

Н рН

W