Устройство для препаративного разделения высокомолекулярных биологических веществ Советский патент 1992 года по МПК G01N27/453 

Изобретение относится к медицине, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к устройствам для осуществления анализа высокомолекулярных биологических веществ (нуклеиновых кислот, белков и др.) методом препаративного электрофореза в полужидких гелях, может быть использовано для фракционного разделения различных видов биологических соединений при проведении разнообразных биохимических исследований указанных веществ и является усовершенствованием известного устройства, описанного в авт. св. Мг434985.

Известна конструкция устройства для препаративного разделения высокомолекулярных биологических веществ, включающая колонку для размещения геля с нанесенным на его исследуемым веществом, сообщающиеся с колонкой верхнею и нижнюю электродные камеры с расположенными в них электродами, капсульную полость, образованную поддерживающим гель фильтром, проницаемым для молекул исследуемого вещества, и мембраной, проницаемой для ионов буферного раствора, .расположенной в нижней части колонки, и трубок для подвода и отвода буферного раствора, сообщающихся с капсульной полостью.

Недостатком устройства для препаративного разделения высокомолекулярных биологических веществ является нежелательный факт частичной миграции исследуемой пробы высокомолекулярных веществ по зазору вдоль стенок верхней части колонки и гелем, что возможно, поскольку гели не прилипают к органическому (или другому) стеклу, что приводит к потери до 8-10% исследуемого образца высокомолекулярных биологических соединений. Проникновение по зазору при старте электрофореза особенО

сх о

но нежелательно при фракционировании уникальных фрагментов нуклеиновых кислот (онкогенов), количество которых в исследуемых пробах минимально.

Цель изобретения - повышение разрешающей способности устройства и улучшение качества выделяемых препаратов за счет устранения утечки (миграции) пробы высокомолекулярных соединений по зазору MS ду стенкой верхней части колонки и гелем при нанесении ее на старт (верхнюю часть) геля перед началом процесса препаративного электрофореза,

С этой целью устройство снабжено кольцевой втулкой наружным диаметром нижней части (1 /2) ее высоты на 4 мм меньше рабочей поверхности геля, которая вводится на 0,3-0.4 мм глубины в гель в момент его полимеризации. В результате этого между стенкой верхней части колонки и кольцевой втулкой (ее наружной стенки) образуется кольцевой зазор в 2 мм, заполненный гелем при его полимеризации. Таким образом, кольцевой формы сформировавшийся гель устраняет контакт образца исследуемой пробы со стенками верхней части колонки и тем самым предотвращает миграцию высокомолекулярных соединений по зазору вдоль стенки верхней части колонки.

На фиг. 1 представлена принципиальная схема предлагаемого устройства; на фиг. 2 - схема крепления кольцевой втулки в верхней части колонки после полимеризации геля,

Устройство включает верхнюю 1 (содержащую гель 19 и втулку 20) и нижнюю 2 части колонки, соединенные резьбовой соединительной втулкой 3. На нижнем торце верхней части 1 колонки закрепляется поддерживающий фильтр 4, выполненный из батиста. Для крепления фильтра 4 с помощью нити (резинового кольца) на наружной образующей верхней части 1 колонки выполнена кольцевая канавка. При соединении верхней части 1 колонки с соединительной втулкой 3 фильтр 4 зажимается между торцами верхней части 1 колонки и упорным буртом втулки 3.

Между торцем нижней части 2 колонки и упорным буртом втулки 3 зажимается мембрана 5, выполненная из целлофана или другого материала, проницаемого для ионов буферного раствора. Нижняя часть 2 колонки имеет в своем теле канал 6, один конец которого соединен отверстием 7 с подмембранным пространством нижней части 2 колонки, а в другом его конце смонтирована гибкая трубка 8. выполненная из

фторопласта. Отверстие 7 расположено в

непосредственной близости от мембраны 5.

Фильтр 4 и мембрана 5 образуют во

втулке 3 устройства капсульную полость 9.

В стенках втулки 3 вмонтированы гибкие трубки 10 и 11, выполненные из фторопласта, сообщающиеся с капсульной полостью 9.

Верхняя часть 1 колонки, содержащая

0 гель 19 и кольцевую втулку 20, герметично монтируется в соединительном патрубке днища верхней электродной камеры 12, в которой закреплен минусовой электрод 13, Нижняя часть колонки закрепляется в ниж5 ней электродной камере 14 таким образом, чтобы торец нижней части 2 колонки располагался от дна камеры 14 на расстоянии, равном 1/4-1/3 высота (глубины) камеры 14. В камере 14 закреплен плюсовой элек0 трод 15. Электроды 13 и 15 выполнены из пластины, позициями 16-18 обозначена тефлоновые трубки.

Работа предлагаемого устройства осуществляется следующим образом.

5 Известными способами приготавливается полиакриламидный гель, концентрация которого выбирается в зависимости от исследуемого вещества.

Под фильтр 4, между верхней частью 1

0 колонки и опорным буртом втулки 3 разме- щают тонкую резиновую пленку, после чего

верхнюю часть 1 колонки заполняют гелем

на высоту 20-30 мм и сразу же известным

способом вводят в нее кольцевую втулку 20

5 на глубину 3-4 мм от поверхности геля. После полимеризации геля верхняя часть 1 колонки, содержащая гель с кольцевой втулкой 20, разъединяется с втулкой 3, резиновая пленка удаляется, после чего верх0 нюю часть 1 колонки с гелем 19 и кольцевой втулкой 2о вновь монтируется во втулке 3. Образовавшийся столбик геля при этом удерживается фильтром 4.

Верхняя 12, нижняя 13 электродные ка5 меры и капсульная полость 9 заполняются буферным раствором (например, трисфос- фатный буфер рН 7,8) и известными способами осуществляется предэлектрофорез для удаления из геля веществ, поглощаю0 щих свет в ультрафиолетовой области. Послезавершенияпроцессапредэлектрофореза верхняя 12 и нижняя 14 электродные камеры заполняются свежим упорным буферным раствором. На поверх5 ность столбика геля внутрь кольцевой втулки 20, находящуюся под слоем буферного раствора, известными способами наносится исследуемое вещество.

Одна из гибких трубок 10, 11 подсоединяется к известному устройству, например

к колбе Мариотта, способному создать постоянный гидравлический напор буферного раствора в капсульной полости 9, при постоянном расходе через полость 9 в заданных пределах. Вторая из гибких трубок 10, 11 соединяется с известным автоматическим коллектором и регистратором фракции ве щества, например типа Увикорд Л КБ;

В верхней 12 и нижней 14 электродных камерах создается известными способами циркуляция буферного раствора с целью сохранения его состава, при этом, с целью предотвращения образования воздушных включений и обеспечения постоянства буферного раствора по рН ионной силе, в под- мембранной полости нижней части 2 колонки отвод буферного раствора из нйж- ней электродной камеры 14 осуществляется через канал 6 и трубку 8.

На электроды 13 и 15 подается постоян- ное напряжение, обеспечивающее требуемую плотность тока электрофореза, При электрофоретическом движении молекул исследуемого вещества столбик полиакри- ламидного геля играет роль молекулярного сита, а связи с чем разные молекулы вещества проникают в капсульную камеру по истечении разных промежутков времени от начала процесса.

Проходящий через капсульную камеру 9 буферный раствор, промывая камеру 9, выносит фракции молекул вещества в автоматический коллектор, в пробирках которого собирают отдельные фракции этих

молекул, деление на которые для конкретного вида исследуемого вещества зависит от времени сбора буферного раствора в каждую пробирку, от времени прошедшего с начала процесса, а также от концентрации полиакриламидного или агарозного геля,, размещенного в колонке устройства.

Предлагаемое устройство для препаративного разделения высокомолекулярных биологических веществ при разделении таких веществ как ДНК, РНК, позволяет устранить утечку (диффузию) пробы высокомолекулярных соединений по зазору между стенками верхней части колонки и гелем и тем самым повысить надёжность работы устройства на 8-10% и получить свыше 20 отдельных фракций ДНК, например онкогены в чистом виде.

Формула и зобретени я

Устройство для преларато&ного разделения высокомолекулярных биологических веществ по авт. се. №434985, от ли чающееся тем, что, с целью повышения разрешающей способности и улучшения качества выделяемых препаратов, устройство дополнительно снабжено полой кольцевой втулкой ступенчатой формы, при. этом диаметр верхней части втулки превышает диаметр нижней части и равен внутреннему диаметру колонки, а диаметр нижней части втулки меньше диаметра верхней части не менее чем на 4 мм.

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к устройствам для осуществления анализа биологических веществ (нуклеиновых кислот белков и др.) методом препаративного электрофореза в полужидких гелях, может быть использова- но для фракционного разделения различных видов биологических соединений при проведении разнообразных биохимических исследований указанных веществ и является усовершенствованием известного устройства, описанного в авт. св. Ns 434985. Целью изобретения является повышение разрешающей способности устройства и улучшение качества получаемых препаратов. Поставленная цель достигается тем, что известное устройство снабжено кольцевой втулкой наружным диаметром на 4 мм меньше рабочей поверхности геля, которую закрепляют специальным держателем и вводят на 0,3г0.4 мм глубины в гель в момент его полимеризации. 2 ил.

2 , Э фиг.1

19

Фиг. 2