Способ электрофоретического анализа нуклеиновых кислот и устройство для его осуществления Советский патент 1991 года по МПК G01N27/26 

у кромки и на дне установлены электроды 5 и 6, погруженные в электродные растворы, расположенные над и под жидкостью 17. В держателе 1 готовят слой геля из раствора мономеров. Для этого держатель 1 снабжен приводом 13 его вращения, кольцевой вставкой 14 с пазами для нанесения проб, гребенкой и крышкой. Однородный по толщине слой геля получают путем вращения держателя со скоростью 800-900 оборотов в минуту и поворота оси его вращения в горизонтальное положение. В держателе 1 возможно приготовление пластины геля с разной концентрацией акриламида. Для

этого он снабжен группой перегородок и тороидальной вставкой, содержащей отверстия и группу камер для растворов мономеров, Для регистрации меченных флюорофорами молекул луч 8 источника 7 направлен в торец слоя 2 геля. Приемник 9 флюоресцентного излучения своим выходом подключен к входу вычислительного блока 11. При этом держатель 1 вращается приводом 13 со скоростью 20-30 об в минуту. Изобретение позволяет повысить произ- водительность и качество анализа и упростить устройство для его осуществления. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 9 ил.

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа нуклеиновых кислот, в частности к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенирова- ния) ДНК или РНК и найдет применение в молекулярно-биологических исследованиях, биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Целью изобретения является повышение производительности и качества разделения. Для этого полиакриламидный гель 2 размещают в держателе 1 по внутренней vi/или наружной его цилиндрической поверхности с образованием споя геля в виде полого цилиндра. Пробы наносят на торец слоя геля по его окружности. Осуществляют термостатирование геля средством, содержащим стакан 16, теплообменник 18 и неполярную жидкость 17. На стакане 16 ы СП S

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа нуклеиновых кислот, а точнее к методу электрофоретического анализа первичной структуры (секвенирования) ДНК или РНК, и найдет применение в молекулярно-биоло- гических исследованиях и биотехнологии, а также в медицине и сельском хозяйстве.

Цель изобретения - повышение производительности и качества разделения.

Цель достигается существенным изменением операций электрофоретического разделения анализируемых проб и конструкции электрофоретической системы.

На фиг. 1 изображено устройство для осуществления способа электрофоретического анализа нуклеиновых кислот, общий вид, разрез, слой геля расположен на внутренней поверхности стакана держателя; на фиг. 2 - то же, слой геля расположен на наружной поверхности стакана держателя; на фиг. 3 -устройство ; перед

приготовлением геяевых пластин, общий вид, разрез; на фиг. 4 - сечение А-А на фиг, 3; на фиг. 5 - съемная гребенка; на фиг, 6сечение Б-Б на фиг. 3; на фиг. 7 - тороидальная вставка в держателе перед приготовлением пластин геля с .различной концентрацией акриламида, разрез; на фиг. 8 - сечение В-В на фиг. 7; на фиг. 9устройство для осуществления предлагаемого способа, общий вид, разрез, слой геля размещен на внутренней и наружной поверхностях стакана держателя.

Устройство содержит установленный вертикально держатель 1 геля цилиндрической формы (фиг. 1) с размещенным в нем гелем 2, электродные растворы 3 и 4, расположенные в верхней и нижней частях держателя 1 и находящиеся в электрическом контакте с гелем. Устройство содержит электроды 5 и 6, погруженные в электродные растворы 3 и 4 и подключенные к источнику тока (не показан) для создания в геле электрического поля, поддействием которого меченные флюрофором молекулы нуклеиновых кислот мигрируют в нижнюю часть геля, где производится регистрация флюоресценции компонетов анализируемой пробы. Для осуществления такой регистрации устройство содержит источник 7 монохроматического излучения, луч 8 которого направлен в нижнюю часть геля 2 для возбуждения флюоресценции молекул, приемник 9 монохроматического излучения, оптически ориентированный на освещаемый источником 7 участок 10 геля для регистрации флюоресцентного излучения молекул, и вычислительный блок 11, вход которого подключен к выходу приемника 9. Таким образом, электрические импульсы, свидетельствующие о наличии в участке 10 геля флюоресцирующих молекул, накапливаются в запоминающем устройстве вычислительного блока 11. После окончания анализа эта последовательность сигналов приемника 9 преобразуется в йычислитель- ном блоке 11 в удобную для оператора форму, отрахоющую первичную структуру анализируемых нуклеиновых кислот.

Держатель 1 выполнен в виде стакана из диэлектрического материала, например полистирола. Возможно также выполнение держателя 1 из нескольких материалов. Например, внутренняя цилиндрическая поверхность его выполнена из стекла для улучшения адгезии слоя геля и поверхности держателя, а остальная его часть - из пол- иметилметакрилата. При этом часть из стекла представляет собой цилиндр, закрепленный в стакане из указанной пластмассы. Наружная и внутренняя боковые поверхности держателя выполнены цилиндрическими. По меньшей мере на внутренней цилиндрической поверхности держателя 1 расположен слой геля 2 (фиг. 1) в виде полого цилиндра с лунками 12 для нанесения анализируемых проб. Лунки 12 выполнены на верхнем торце слоя геля по окружности. Держатель 1 геля снабжен при водом 13 его вращения вокруг оси, при этом держатель закреплен на валу 14 привода 13 посредством фланца 15, Привод 13 снабжен механическим генератором опорных импульсов, количество которых на оборот вала 14 равно количеству дорожек для анализируемых проб в геле 2. Кроме того один из опорных импульсов - начальный и имеет длительность больше, чем все остальные опорные импульсы. Он соответствует положению первой дорожки в позиции оптического входа приемника 9. Выход генератора опорных импульсов подключен к входу вычислительного блока 11.

Устройство снабжено средством термо- статирования, содержащим стакан 16 из диэлектрического материала, например полиметилметакрилата, установленный ко- аксиально со стаканом держателя 1 и с зазором между боковыми стенками и дном относительно этого стакана. В указанном зазоре расположены неполррная жидкость 17, например смесь гексанз и четыреххло- ристого углерода с плотностью 1,06 ± С,01 г/см , и теплообменник 18 лз стеклянной трубки, закрепленный на стакане 15 и подключенный через патрубки 19 и 20 к водяному термостату (не показан). Стрелкам / показано направление протекания воды через теплообменник. На стакане 16 установлены электроды 5 и б, выполненные из платиновой проволоки в виде колец. Стакан 16 имеет на дне выступ 21, на котором установлен нижний электрод 5. При размещении слоя геля на внутренней цилиндрической поверхности держатели 1 электрод 5 установлен с наружной стороны стакана 16(фиг. 1). Электродные растворы 3 и 4 расположены в зазоре между стаканом держатели 1 и стаканом 16 под неполярной жидкостью 17 и над ней. Линиями 22 и 23 показаны границы между неполярной жидкостью 17 и электродными растворами 3 и 4. Плотность нижнего электродного раствора 3 составляет 1,10 ±0,01 г/см, что достигается за счет присутствия в нем. сахарозы, плотность раствора 4 около 1,0 г/см3. Таким образом раствор 3, неполярная жидкость и раствор 4 располагаются в стакане 1 в необходимой последовательности (фиг. 1).

При размещении слоя геля на наружной цилиндрической поверхности стакана 1 держателя (фиг. 2) последний установлен внутри стакана 16 средства термостатирования. В качестве слоя геля используются готоьые пластины геля 2 с лунками 12 для анализируемых проб, которые закрепляются на по- верхности стакана держателя с помощью мягких пружинных колец (не показаны). Электрод 5(фиг. 2)установлен с внутренней стороны стакана 16 на выступе 21.

При размещении геля на внутренней

0 поверхности стакана держателя путем заливки в него раствора мономеров, образующего при полимеризации гель, стакан держателя 1 (фиг. 3 и 4) содержит в верхней части кольцевую вставку 24, выполненную,

5 например, из политетрафторэтилена. На наружной ее цилиндрической поверхности выполнены идентичные пазы 25 (фиг. 4 и 3) в форме кольцевых сегментов, образующих щели между внутренней поверхностью ста0 кана держателя 1 и вставкой 24. Для образования лунок 12 (фиг. 1) при полимеризации геля в стакане держателя 1 он снабжен схемными гребенками 26 (фиг. 5) с выступами 27, расположенными в ука5 занных щелях. Для установки гребенок 26 в стакан держателя 1 на наружной поверхности кольцевой встацки 24 выполнена также кольцевая проточка 28 (фиг. 1) ка глубину пазов 25. Стакзн держателя 1 снабжен так0 же герметизирующим кольцом 29, выполненным, например, из вакуумной резины, и крышкой 30 стакана держателя 1. Гребенки 26, кольцо 29 и крышка 30 установлены последовательно при формировании слоя геля

5 из раствора мономеров. Крышка 30 скабжа- . нэ отверстием 31 для заливки этого раствора Б стакан держателя 1. Крышка закрепляется с помощью фиксаторов (не показаны) за выступ 32 стакана держателя 1.

0 Привод 13 вращения держателя геля установлен на поворотной платформе 33 (фиг. 3)для поворота оси вращения держателя на 90°. С этой целью устройство снабжено приводом 34 платформы 33, с которым она сое5 динена посредством вала 35. Платформа снабжена фиксаторами крайних положений (не показаны).

Стакан держателя 1 содержит группу перегородок 36 (фиг. 3) из диэлектрического

0 ма ериала, например полиметилметакрилата, установленных равноудаленно на его внутренней поверхности вдоль образующей от дна стакана до кольцевой вставки 24. Перегородки 36 выполнены Т-образными в

5 сечении (фиг. 6).

При формировании слоя геля, состоящего из отдельных пластин, устройство дополнительно снабжено тороидальной вставкой 37, закрепленной на крышке 30 посредст- - вом четыре стоек 38, и содержит выполненные из полиметилметакрилата корпус 39, крышку 40 и перегородки 41, количество которых равно количеству перегородок 36 (фиг. 8). Перегородки 41 образуют в полости вставки 37 камеры равного объема. В верхней части наружной боковой стенки тороидальной вставки 37 в месте соеденения крышки 40 и корпуса 39 в последнем выполнены прямоугольные отверстия 42 (фиг, 7 и В ) для выхода растворов мономеров из камер вставки 37 при вращении стакана держателя. Для внесения растворов мономеров в камеры тороидальной вставки 37 в крышке 30 выполнены отверстия 43.

Возможно выполнение стакана держателя, при котором его внутренняя боковая поверхность равномерно расширяется от его верхнего торца ко дну (не показано). Конусность при таком выполнении составляет около 0,07° или 0,001 рад.

В устройстве (фиг.. 1 и 2) источник 7 монохроматического излучения установлен так, что луч 8 от него направлен вдоль образующей стакана держателя в нижний торец слоя геля, а приемник 9 закреплен в боковой стенке стакана 16 или средства термостати- рования и оптически ориентирован перпендикулярно слою геля.

При размещении слоя геля на внутренней и наружной цилиндрической поверхностях стакана держателя 1 (фиг. 9) устройство содержит модулятор 44 луча света источника 7 монохроматического излучения для направления луча 8 попеременно (лучи 45 и 46} в торец каждого из слоев геля. Для регистрации флюоресценции, возникающей в геле 2, устройство содержит также дополнительный приемник 47 монохроматического излучения, выход которого подключен к входу 48 блока 11, при этом выход приемника 9, регистрирующего излучение слоя геля 2, подключен к входу 49 этого блока.

При таком выполнении устройства стакан держателя 1 (фиг. 9) снабжен цапфой 50 на дне стакана и фланцем 51 в его верхней части для обеспечения возможности его вращения. С этой целью стакан установлен цапфой 50 в опоре 52 и снабжен подшипником 53, установленным вблизи фланца 51. Фланец 51 выполнен в виде шкива зубчато- ременной передачи, осуществляемой также посредством зубчатого ремня 54 и ведущего шкива 55, закрепленного на валу 56 привода 13 вращения держателя вокруг оси. Опора 52 установлена в выступе 21 стакана 16 средства термостатирования.

Стакан держателя 1 установлен коакси- ально внутри стакана 16 средства термостатирования (фиг. 9), В стакане 1 установлен коаксиально стакан 16 средства термостатирования. В зазорах между этими стаканами находятся электродные растворы 3 и 4 и неполярная жидкость 17, а также теплообменники 18, подключенные через патрубки

19 и 20 к водяному термостату, На стаканах 16 установлены кольцевые электроды 5 и G, подключенные к источнику тока,

Устройство работает следующим образом.

0В стакан держателя 1 в его вертикальном положении устанавливают кольцевую вставку 24 до соприкосновений ее нижнего торца с перегородками 36 (фиг. 3) и так, чтобы кольцевая проточка 28 (фиг, 1) оказа5 лась сверху. Затем в эту проточку и в щели, образованные пазами 25, устанавливают гребенки 26 (Фиг, 5), после чего - кольцо 29 v, крышку 30 (фиг 3). Последнюю закрепляют в держателе фиксаторами за выступ 32,

0 что обеспечивает герметичное прижатие кольца 29 к стакану держателя 1.

Через отверстие 31 в крышке 30 вводят до дна держателя трубку для подачи инертного газа или азота и осуществляют ззпол5 нение стакана держателя этим газом в течение 2-3 мин при расходе газа 5-10 л в минуту.

Затем газовую трубку удаляют и через отверстие 31 в стакан заливают смесь моно0 меров. Объем смеси предварительно рассчитывают, исходя из необходимости толщины слоя геля. Сразу после заливхи смеем включают привод 13 вращения держателя и увеличивают скорость его вращз5 нил до 80,0-900 об. в минуту. В результате раствор мономерог покрывает всю внутреннюю цилиндрическую поверхность стакана, но толщина слоя геля при этом неодинакова по высоте стакана. Затем включают привод

0 34 (фиг. 3) и одновременно отключают фиксатор вертикального положения стакана держателя 1 для перевода оси его вращения в горизонтальное положение. По достижении стаканом держателя 1 этого положения

5 включают фиксатор горизонтального положения стакана держателя 1. В этом положении смесь мономеров покрывает поверхность стакана держателя 1 равномерным слоем одинатоковой толщины и за0 текает также в щели, образованные пазами 25 кольцевой вставки 24 и стаканом держатели 1. При этом пузыри воздуха из этих щелей выдавливаются через участки соприкасающихся поверхностей гребенки, пазов

5 25 и стакана держателя 1 раствором мономера за счет действия на него центробежных сил,

Вращение стакана держателя 1 в гор- зонтальном его положении проводят в течение 20-30 мин, за это время происходит

полимеризация мономеров с образованием слоя геля. Затем стакан держателя возвращают в вертикальное положение приводом 34 и снимают крышку 30 и кольцо 29. На этом заканчиваются операции размещения слоя геля на внутренней цилиндрической поверхности стакана держателя 1 путем заливки в него раствора мономеров.

Для продолжения анализа в стакане держателя 1 (фиг. 1) подвешивают и жестко закрепляют коаксиально с ним и с зазором стакан 16 средства термостатирования с закрепленными на нем электродами 5 и 6, теплообменником 18 и приемником 9. В зазор заливают сначала нижний электродный раствор 3 до уровня, расположенного немного ниже оптического входа приемника 9, после чего заливают неполярную жидкость примерно до половины высоты кольцевой вставки 24, затем верхний электродный раствор до выступа 32 (фиг. 1 и 3). Пинцетом извлекают из проточки 28 гребенки 26 и шприцом промывают гелевые торцы в лунках 12, используя для этого раствор 4.

Включают термостат и прогревают неполярную жидкость до необходимой температуры, равной обычно 323 К, на торцы геля в лунках 12 наносят капилляром анализируемые пробы в объеме 1-2 мкл и подают необходимое напряжение на электроды 5 и 6. Затем включают привод 13 стакана держателя 1 и устанавливают скорость его вращения равной 20-30 об. в минуту. После этого включают источник 7, приемник 9 и вычислительны и блок 11. В результате начинается электрофоретическое разделение анализируемых проб при контролируемых температурных условиях и прогрев блоков регистрации (источника 7, приемника 9 и вычислительного блока 11).

Под действием электрического поля молекулы нуклеиновых кислот мигрируют в направлении анодного торца геля (фиг. 1). В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, что приводит к разделению смеси молеку/; на отдельные ее компоненты, каждая из которых представлена в геле зоной, содержащей одинаковые молекулы, мигрирующие с одной скоростью. В нижней части геля 2 (фиг. 1) достигается оптимальное разделение этих зон и они могут быть зарегистрированы раздельно. Для регистрации молекул нуклеиновых кислот в процессе их электрофоретического разделения к ним перед анализом ковалентно присоединяют молекулы флюоренсцирующего вещества, служащего меткой анализируемых молекул.

По достижении лидирующей зоной участка 10 геля начинается автоматическая регистрация компонентов анализируемых проб. При этом по опорным и начальному импульсам, поступающим в блок 11 от привода 13, в группы ячеек памяти блока 11, количество которых равно количеству дорожек для анализируемых проб, заносятся импульсы, поступающие от приемника 9. За время электрофоретического прохождения любой из зон участка 10 геля проводится

0 несколько десятков измерений интенсивности флюоресценции каждой из зон. Это позволяет уменьшить статистическую погрешность результатов анализа.

С целью повышения производительно5 сти анализа путем сокращения времени его выполнения в устройстве возможно проведение анализа одновременно в нескольких пластинах геля, имеющих различную концентрацию акриламида. Анализ в устройст0 ве в этом случае выполняют следующим образом.

После установки в стакан держателя 1 кольцевой вставки 25 (фиг, 3-5), гребенки 26 и кольца 29 з него устанавливают крышку 30

5 (фиг. 7)с закрепленной на ней тороидальной вставкой 37. Крышку 30 поворачивают вокруг оси стакана держателя 1 так, чтобы перегородки 41 оказались напротив перегородок 36 стакана держателя 1 (фиг. 8),

0 после чего крышку 30 закрепляют фиксаторами аналогично указанному. Осуществляют заполнение стакана держателя 1 инертным газом или азотом и затем через отверстие 43 в крыщке 30 (фиг. 7) заливают

5 в камеру вставки 37 растворы мономеров. . Количество отдельно приготовленных растворов равно количеству камер, а растворы с одинаковой концентрацией акриламида заливают в камеры, расположенные во

0 вставке 37 одна напротив другой. Таким образом с помощью вставки 37 (фиг. 7 и 8) заливают четыре пластины геля, из которых две имеют низкую, например 8%, а две - высокую, например 16%, концентрации ак5 риламида.

Включают привод 13 и по мере увеличения оборотов стакана держателя 1 растворы мономеров выливаются за счет центробежных сил из камер через отверстия 42 на

0 позерхность стакана держателя 1, причем каждый раствор - на участок, ограниченный перегородками 36, дном стакана держателя 1, вставкой 24 и гребенкой 26. Быстро возрастающие центробежные силы препятст5 вуют стеканию растворов на дно стакана держателя 1. Дальнейшая работа устройства аналогична указанной за исключением операции внесения в лунки 12 (фиг. 1) анализируемых проб. Каждую пробу разделяют на две части, одну из которых наносят на

гель с низкой концентрацией акриламида, а другую - на гель с высокой его концентрацией.

Возможно использование готовых пластин геля, При размещении пластин геля на наружной цилиндрической поверхности стакана держателя 1 устройство работает следующим образом.

П р и м е р 1. Подготовку устройства к заливке в стакан держателя 1 раствора мономеров проводят по (фиг. 1). Раствор мономеров готовят из расчета получения слоя геля толщиной 0,3 мм, объемом 36 мл в стакане держателя, имеющем внутренний диаметр 200 мм и высоту поверхности для слоя геля 200 мм. Раствор мономеров для проведения секвенирующего электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях содержит в 36 мл раствора 2,9 г акриламида, 0,15 г бисакриламида, 0,036 мл ТЕМЕД, 0,018 г персульфата аммония, 0,39 г трис-ОН, 0,2 г борной кислоты, 0,035 г ЭДТА (натриевая соль) и 15,1 г мочевины.

Затем раствор мономеров сразу после приготовления (персульфат аммония и ТЕМЕД добавляют в последнюю очередь) заливают в стакан держателя 1 и выполняют операции полимеризации слоя геля. Слой геля после полимеризации раствора мономеров имеет гладкую поверхность без остатков жидкой фазы.

Используют электродные растворы следующего состава. Раствор 4 (верхний); 1 л раствора содержит 10,8 Трио ОН, 5,5 г борной кислоты, 0,93 г ЭДТА Na2 2НаО и рН 8,3, раствор 3 (нижний) - те же компоненты и дополнительно в 1 л 260 г сахарозы. 8 качестве неполярной жидкости используют смесь гексана и четыреххлористого углерода с плотностью 1,06±0,01 г/см3.

Растворы заливают в указанной последовательности, после чего выполняют остальные операции до нанесения анализируемых проб на гель.

В каждую лунку 12 (фиг. 1) вносят по 1,5 мкл раствора 4, содержащего мочевину (7 М) и по 0,025% маркерных красок: бромфено- лового голубого и ксиленцианолового, после чего на электроды подают напряжение. Электрофорез ведут при напряжении 650 В, при этом величина тока через слой геля составляет 70-75 мА. Скорость движения красителей составляет для бромфенолового голубого, имеющего электрофоретическую подвижность, эквивалентную молекулам ДНК или РНК длиной в 25-30 нуклеотидов, 175 мм в час, для ксиленцианолового, имеющего подвижность, эквивалентную молекулам длиной 70-85 нуклеотидов. 93 мм в

час. Результаты замеров расстояний, пройденных красками через 1 и 2 ч во всех дорожках слоя геля дали разбор значений 0,3-0,5 мм, что при разрешении зон, оавном

1,2-1,4, достигаемом в пластине используемой длины, соответствует погрешности электрофоретического анализа менее 0,5%. П р и м е р 2. Подготовку проб, меченных флюорофором, для определения первичной

0 структуры ДНК по предлагаемому способу проводят следующим образом.

Набор фрагментов секвенируемой молекулы ДНК получают методом терминирования реакции полимеразного копирования

5 ДНК по Сенгеру. Для мечения фрагментов ДНК флюорофором используют химически синтезированную олинонуклеотидную затравку. Синтез фрагментов ДНК ведут в системе фага М13. Затравку коньигируют с

0 флюоресцеином.

К 2 мкл раствора, содержащего около 0,2 пмоль анализируемой ДНК, добавляют 0,6 пмоль меченной затравки в объеме 0,5 мкл. Затравка должна быть растворена в

5 десятикратном буферном растворе следующего состава: 0,5 М NaCI, 66 мМ трис-НС1, рН 7,4, 66 мМ MgCia, Ю мМ ДТТ. Тщательно перемешивают полученную смесь и помещают ее в кипящую водяную баню объемом

0 500 мл на 3 мин. Затем баню выключают и оставляют остывать до комнатной температуры, что происходит примерно в течение двух часов. По окончании в реакционной смеси образуются гибридные молукулы

5 ДНК + затравка. Затем к смеси добавляют до конечного объема 10 мкл буферный раствор состава; 50 мМ трис-HCI, рН 8,5 мМ MgCl2, 2 . Разбавленную таким образом смесь делят по 2 мкл в четыре пробир0 ки для проведения реакции терминирования полимеразного копирования по четырем основаниям.

В каждую пробирку добавляют по 1 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов

5 (dN TP), конценрация каждого 0,125 мМ, и по 1 мкл соответствующих дидезоксирибо- нуклеозидтрифосфатов (ddN TP) в следующих молярных соотношениях: d A/dd , dT/dd , dG/ddG 6, dC/ddC 2,5. В каж0 дую пробирку добавляют по 1 мкл раствора . обратной транскриптазы с удельной активностью 1 ед./мкл, тщательно перемешивают и инкубируют при 37° С в течение 15 мин. Затем в каждую пробу добавляют по 1 мкл

5 смеси dN TP в концентрации 0,5 мМ каждого и инкубируют еще 15 мин. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 99%-ного раствора формамида с красками: бромфеноловым голубым и ксиленцианоло- вым (0,5% каждого) и 20 мМ ЭДТА.

Проводят полимеризацию слоя геля в держателе 1 (фиг. 1) и заливку электродных растворов неполярной жидкости по примеру 1. Пробы, полученные ранее, кипятят в течение 3 мин и наносят на гель. В каждую лунку 12 вносят по 2 мкл анализируемой пробы и проводят злектрофоретическое разделение и регистрацию компонентов анализируемых проб указанным образом. При регистрации в устройстве используют аргоновый лазер в качестве источника 9 монохроматического излучения. Для выделения флюоресцентного излучения используют интерференционный фильтр на 520 нм.

В изобретении использование радиаль- но-симметричного принципа при размещении слоя геля в держателе, при его термостатировании и регистрации компонентов анализируемых проб позволяет повысить производительность и качество анализа и упростить устройство для его проведения. Например, при диаметре стакана держателя, равном 240 мм, анализ можно вести по 160 дорожкам, т.е. параллельно анализировать первичную структуру 40 фрагментов ДНК длиной по 300 нуклеоти- дов каждый. Это соответствует производительности секвенирования, равной 25-30 тыс. нуклеотидов в сутки, т.е. в 25-30 раз выше, чем при использовании известного устройства. При этом увеличение ширины геля с целью дальнейшего повышения производительности анализа приводит к увеличению диаметра стакана держателя лишь на 1 /3. Таким образом, в устройстве луч источника монохроматического излучения направлен в нижнюю часть геля, приемник монохроматического излучения оптически ориентирован на освещаемый источником монохроматического излучения участок геля, вычислительный блок входом подключен к выходу приемника монохроматического излучения, держатель геля выполнен в виде стакана из диэлектрического материала, по меньшей мере на внутренней цилиндрической поверхности которого расположен слой геля в виде полого цилиндра с лунками для анализируемых проб на его торце по окружности, держатель геля снабжен приводом его вращения вокруг оси, имеется средство тер- мостатирования, содержащее стакан из диэлектрического материала, установленный коаксиально со стаканом держателя и с зазором между боковыми стенками и дном относительно этого стакана, неполярную жидкость и теплообменник, расположенные в зазоре между стаканами, электроды выполнены кольцевыми и установлены коаксиально со стаканом средства

термостатирования один в верхней части этого стакана, а другой - на дне этого же стакана снаружи или внутри, при этом электродные растворы расположены в зазоре между стаканами под неполярной жидкостью и над ней,

Такое выполнение способа электрофоре гического анализа нуклеиновых кислот и устройства для его осуществления позволя0 ет резко поьысить производительность анализа за счет увеличения ширины пластины геля и, следовательно, количества дорожек для анализируемых проб.

Благодаря радиально-симметричному

5 расположению геля, электродов и элемента термостатирования и выбору направления электрофореза вдоль образующей обеспечиваются идентичные для всех дорожек условия разделения анализируемых молекул.

0 Вследствие этого повышается качество анализа: улучшаются достоверность и воспроизводимость результатов и повышается их точность.

Вращение держателя вокруг его оси в

5 процессе электрофореза, осуществляемое с целью регистрации компонентов анализируемых проб, обеспечивает вместе с тем постоянное и равномерное перемешивание как буферных растворов, так и неполярной

0 жидкости, что также способствует повышению качества анализа за счет поддержания однородного состава буферных растворов, удаления пузырьков газа с электродов и улучшения теплопередачи неполярной жид5 кости.

Перемещение геля относительно луча источника монохроматического излучения, осуществляемое путем вращения держателя, обеспечивает одинаковые и геометриче0 ски правильные стартовые участки гелевой пластины. Кроме того, упрощение устройства достигается за счет простых и надежных средств герметизации и исключения необходимости в спейсе-рэх (прокладках, опре5 деляющих толщину гелевой пластины).

Заливку раствора мономеров в держатель и его вращение до достижения скорости, при которой раствор мономеров покрывает всю внутреннюю цилиндриче0 ск/ю поверхность держателя, осуществляют при вертикальном расположении оси вращения держателя, а окончательную полимеризацию геля - при горизонтальном ее расположении. Для этого в устройстве при5 вод вращения держателя геля установлен на поворотной платформе для поворота оси вращения держателя и, следовательно, повышает качество анализа.

При формировании слоя геля, состоящего из отдельных пластин, оно дополнительно снабжено тороидальной вставкой для размещения раствора мономеров, закрепленной на крышке стакана держателя, с радиальными перегородками по количеству перегородок стакана держателя и с отвер- стаями, выполненными э верхней части ее наружной боковой стенки.

Это позволяет сформировать в одном держателе несколько пластин геля, имеющих различную пористость и. следователь- но,оказывающихразличное

задерживающее воздействие на низкомолекулярные и высокомолекулярные компоненты анализируемых проб, Тем самым достигается выравнивание разрешения ука- занных компонентов проб, т.е, повышение качества анализа. Возможность осуществления этого в одном держателе и в ходе одного и того же анализа обеспечивает повышение производительности работы и уп- рощение устройства для осуществления анализа. Вместе с тем использование пластин геля с разной концентрацией акрила- мида для анализа одной и той же пробы позволяет сократить время его проведения, так как высокомолекулярные компоненты пробы можно регистрировать в пластине с низким содержанием акриламида, где их подвижность выше, чем в пластине с низкой пористостью. Необходимое разделение низкомолекулярной части анализируемой пробы достигается за то же время в пластине с высоким содержанием акриламида. Таким образом, за счет сокращения времени анализа достигается повышение его произ- водительности.

Внутренняя боковая поверхность стакана держателя выполнена равномерно расширяющейся от его верхнего торца к дну. Благодаря этому возможно получение пла- стины геля, у котброй сечение равномерно возрастает от стартовой зоны в направлении миграции анализируемых молекул. Это приводит к постепенному снижению плотности тока в указанном направлении, что способствует выравниваю разрешения для коротких и длинных полимерных цепей нуклеиновых кислот. Таким образом достигается повышение качества анализа.

Источник монохроматического излуче- ния установлен так, что луч света от него направлен вдоль образующей стакана держателя в нижний торец слоя геля, а прием- ник монохроматического излучения закреплен в боковой стенке средства термо- статирования вблизи его дна и оптически ориентирован, перпендикулярно слою геля.

Такое выполнение системы регистрации компонентов анализируемых проб позволяет устранить влияние флюоресценции

материала стакана держателя на результаты измерения флюоресценции анализируемых молекул благодаря тому, что участок держателя, освещаемый источником излучения, пространственно отделен от участка, на который сориентирован приемник монохроматического излучения. Это обеспечивает повышение качества анализа.

Ошибка анализа при использовании изобретения в 2-3 раза ниже, чем при использовании известного. Однако это не единственный показатель повышения хачз- ства, необходимо также учитывать факторы, не поддающиеся прямой количественной оценке. Это уменьшение вероятности критических ситуаций и сбоев и снижение влияния дестабилизирующих факторов на процесс анализа.

Формула изобретения

в виде коаксиально расположенных стаканов из диэлектрического материала, установленных с зазором, в котором циркулирует хладагент, в качестве которого использована неполярная жидкость, причем электродные растворы расположены в зазоре между стаканами над неполярной жидкостью и под ней, электроды выполнены кольцевыми и установлены коаксиально по отношению к центральной оси, при этом стакан держателя содержит в верхней части кольцевую вставку с выполненной на ее наружной цилиндрической поверхности группой индентичных пазов в форме кольцевых сегментов, образующих щели между внутренней поверхностью стакана держателя и вставкой, и группу Т-образных перегородок

0

5

из диэлектрического материала, установленных равноудаленно на его внутренней поверхности вдоль образующей от дна стакана до кольцевой вставки, причем внутренняя боковая поверхность стакана держателя выполнена равномерно расширяющейся от его верхнего торца ко дну.

2

Фиг. 2

35

L

гИ

У.

35

34

Ј

Фиг 4

16

4 Хй

W2.J

Фиг.&

43

40/

Фиг. 6

43

Фаг, 7

© с

го «ха

ч