Способ определения циркулирующих иммунных комплексов, содержащих С @ -фракцию комплемента Советский патент 1992 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к мялинмыв может использоваться в клинической

иммунологии для определения циркулирующих иммунных комНлексов, содержащих Сз- фракцию комплемента.

-Целью изобретения является сокращение времени анализа и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения суспензии эритроцитов кровь донора 0(1) Rh-группы берут из локтевой вены в количестве 4 мл в пробирку, содержащую 0,1 мл. 2,5 ед. гепарина, и центрифугируют при 1500 об/мин 15 мин с последующим удалением надосадка. Осадок, содержащий эритроциты, трижды отмывают центрифугированием при 1500 об/мин по 10 мин. Для промывки используют фосфат- но-солевой буфер рН7,2-7,4. Полученный после отмывки осадок разводят фосфатно- солевым буфером до получения 3-5% суспензии эритроцитов, 0,3-0,5 см3 эритроцитов,смешивают с 9,5-9,7 мл фосфато-солевого буфера. После чего 1,5 мл полученной 3-5% суспензии эритроцитов донора смешивают с 1,5 мл нормального человеческого иммуноглобулина в разведении 1:200 и инкубируют при 37°С в течение 20-30 мин с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок доводят фосфатно-солевым буфером до 1.5 мл и используют для последующего определения.

Использование предлагаемого разведения иммуноглобулина позволяет получить концентрацию белка в растворе в пределах 0,5-1,1 мг/мл, т.е. в пределах максимальной чувствительности спектрофотометрическо- го способа учета. Выбор в качестве клеток- сорбентов эритроцитов донора 0(1) Rh-группы позволяет свести к минимуму возможность видовой и групповой агглютинации, так как указанная группа считается универсальной. В данном случае остальными системами гистосовместимости можно

У

Ё

О

00

пренебречь, поскольку необходимо исключить возможность прямого гемолиза.

Использование равных объемных соотношений эритроцитов и иммуноглобулина обеспечивает адекватный контакт Fc-pe- цепторов клеток с Fc-цепями иммуноглобулина, что объесняет также и выбранный температурный режим.

Для исследования кровь обследуемого берут натощак из локтевой вены в количестве 3,5-3 мл и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1:3 и 1,5 мл разведенной сыворотки смешивают с 1,5 мл 3-5 % суспензии донорских эритроцитов, полученной по приведенной методике. Инкубацию смеси проводят в течение 40-45 мин при комнатной температуре. По истечении сроков инкубации смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин и измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости против контрольной пробы на спектрофотометре при длине волны 450 нм, Полученное значение оптической плотности отражает количество циркуляции иммунных комплексов, содержащих Сз-фракцию комплемента. В качестве контрольной пробы используют смесь: 1,5 мл разведенной 1:3 исследуемой сыворотки, 1,5 мл физиологического раствора, которую обрабатывают параллельно с основной пробой,

Использование в этом случае равных объемных соотношений сыворотки и суспензии эритроцитов обеспечивает полноценный контакт рецепторов и иммунных комплексов, содержащих Сз-фракцию комплемента. При избытке эритроцитов «не все рецепторы к Сз загружены иммунными комплексами, что искажает результат, тогда как при избытке сыворотки возможно избыточное содержание иммунных комплексов по сравнению с общим количеством рецепторов к Сз-Фракции, не учитываемых вследствие этого, что также ведет к ошибочным результатам.

Выбранный температурный режим инкубации объясняется вероятностью спонтанной агглютинации эритроцитов, что наблюдается в ходе экспериментов при использовании температур, превышающих 30-37°С. При использовании нижних температур адекватного контакта не происходит. Таким образом, выбранный температурный режим является оптимальным и позволяет обойтись без дополнительных технических средств (те рмостат, хол оди л ьникит.п.).

Пример 1.

Больной Краско Р. С., поступил в городскую инфекционную больницу № 30 им. С,

П. Боткина г. Ленинграда 14.1.89 в тяжелом состоянии с жалобами на боли в области печени, тошноту, рвоту, сильную слабость с диагнозом направления - хронический вирусный гепатит в цирротической стадии. Несмотря на проводимую терапию состояние больного прогрессивно ухудшалось, нарастала желтуха, асцит, усилились проявления геморрагического синдрома, появились

проявления печеночной энцефалопатии. В последующем развилась острая печеночная недостаточность, отмечались носовые и желудочные кровотечения, протромбиновый индекс упал до 30-25%, на фоне нарастающих явлений острой печеночной недостаточности больной скончался 21.3.89. Клинический диагноз: хронический вирусный гепатит В, HBs Ag. тяжелое течение. Портальная гипертензия. Острая печеночная недостаточность.Прекома 1. Кома. Диагноз подтвержден патолого-анэтомически. За время нахождения в больнице больной трижды был обследован предлагаемым способом. Использовалась 3%-ная суспензия

эритроцитов доноров 0(1) Rh-группы, 1,5 мл которой обрабатывали 1,5 мл нормального человеческого иммуноглобулина в разведении 1:200.1,5 мл сыворотки больного, разведённой 1:3, инкубировали в течение 40 мин

с 3%-ной суспензией эритроцитов, груженных иммуноглобулином. Измерение проводили при длине волны 450 нм против контрольной пробы на спектрофотометре СФ-46.

Было выявлено, что по мере ухудшения состояния больного наблюдалось нарастание содержания циркулирующих иммунных комплексов, содержащих Сз-фракцию комплемента, резко увеличившегося при нарастанин явлений острой печеночной недостаточности, приведшей в итоге к летальному исходу.

Пример 2. Больная Кардава М. И., поступила в городскую инфекционную больницу № 30 им. С. П. Боткина г. Ленинград с жалобами на кожный зуд, тошноту, боли в области печени, сильную слабость, потерю аппетита в состоянии средней тяжести с. диагнозом направления острый вирусный

0 гепатит. По результатам клинико-биохими- ческого обследования был поставлен диагноз: острый вирусный гепатит В, HBsAg, тяжелое течение. Прекома 1. Больная находилась в отделении реанимации и интенсив5 ной терапии, где проводилась массированная терапия, на фоне которой состояние больной постепенно улучшалось, явления острой печеночной недостаточности регрессировали. Больная была переведена в отделение, где продолжалась

терапия, на фоне которой состояние больной продолжало улучшаться и она была выписана по выздоровлении на 56-й день госпитализации.. За время нахождения в больнице трижды проводилось обследование предлагаемым способом. Использовали 5%-ную суспензию эритроцитов донора 0(1) Rh-группы, предварительно обработанные нормальным человеком иммуноглобулином в разведении 1:200, которые инкубировали в течение 45 мин с сывороткой больной в разведении 1:3. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 450 нм.

Содержание циркулирующих иммунных комплексов, содержащих Сз-Фракцию комплемента, снижалось по мере регрессии явлений печеночной недостаточности, достигнув к выписке нормальных цифр, тогда как общее количество циркулирующих иммунных комплексов в фазе ре кон вал ес- ценции остается повышенным.

Использование предлагаемого способа позволяет упростить определение циркулирующих иммунных комплексов, содержащих Сз-Фракцию комплемента и сократить сроки исследования в 9-12 раз в известном

способе затрачивается на исследование 24- 36 ч, а в предложенном способе 2-4 ч), снизить стоимость исследования в 8-10 раз за счет отказа от использования клеточной линии RAJI, а также1251-меченной антисыворотки против иммуноглобулинов и дорогостоящего устройства для регистрации результатов радиоиммунного метода применять доступное недорогое оборудование и реактивы отечественного производства.

Форму л а и зоб ре тени я Способ определения циркулирующих иммунных комплексов, содержащих Сзфракцию комплемента, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее с клетками-сорбентами, .центрифугирование, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа и упрощения

способа, в качестве клеток-сорбентов используют человеческие донорские эритроциты 0(1) Rh-группы, обработанные нормальным человеческим иммуноглобулином, и после центрифугирования в надосадке определяют количество циркулирующих иммунных комплексов спектрофотометри- чески.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения циркулирующих иммунных комплексов, содержащих Сз-Фракцию комплемента. Цель изобретения - сокращение времени анализа и упрощение способа. У обследуемого берут кровь, выделяют сыворотку, инкубируют ее с донорскими эритроцитами человека 0(1) Rh-группы, предварительно обработанными нормальным иммуноглобулином человека. Затем проводят центрифугирование и в надосадке определяют спектрофотометрически количество циркулирующих иммунных комплексов, содержащих Сз-Фракцию комплемента. По сравнению с известным способом сокращается время анализа в 9-12 раз и упрощается данный способ.