Способ получения диагностикума для выявления антител к ВИЧ Советский патент 1992 года по МПК C07K17/00 G01N33/547 

Изобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

Известен способ иммобилизации пептидов на планшетах для микротитрованйя, Способ заключается в том, что на поверхности пластика адсорбируют белки. Время сорбции составляет 12-24 ч. Количество белка составляет 100-200 кг на лунку/

Недостатком данного способа иммобилизации пептидов, основанного на фийичвг ской сорбции, является десорбция пептидов на последующих стадиях анализа, что снижает чувствительность метода анализа.

Наиболее близким к предлагаемому йвляется способ получения тест-системы Эпитрн. Способ заключается в том, что

смесь 3 различных синтетических пептидов (соответствующих антигенным детерминантам мембранных белков ВИЧ I и ВИЧ М: H1V1 LAVEL1,41HIV2ROD, HI VI 2з вносят в лунки полистирольных планшет и инкубируют в течение 36 ч при 37°С. После отмывки боратным буфером планшеты подсушивают при 37°С в течение 6ч.

Однако у данного способа недостаточная чувствительность анализа антител с помощью планшет (максимальный титр сыворотки больного не превышает 1:100, 1:200 - максимальное разделение сыворотки больного, при котором еще наблюдается цветная реакция), вызванная десорбцией пептидов во время анализа; неравномерная сорбция пептидов полистирольной матрицей планшет, что снижает воспроизводимость результатов анализа антител.

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности определения.

Для этого полистирол активируют 0,10,01%-ным водным раствором глутарового альдегида в течение 20-30 мин при 37°С. К активированному полистиролу присоединяют альдоенолдекстран в концетрации 1-4 мкг/мл при рН 7,5-8,5. 37°С в течение 3 ч и затем осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1-4 мкг/мл с альдоенолдекстраном при рН 7,5-8,5, 40-60°С в течение 20-24 ч.

Ковалентное присоединение пептидов к планшетам прочными химическими связями увеличивает сорбционную емкость планшет. Десорбции пептидов при последующих анализах не наблюдается, что повышает чувствительность анализа антител. Альдоенолдекстран образует ножку между материалом планшет и пептидами, что делает пептиды стерически более доступными для взаимодействия антиген-антитело. Это также приводит к увеличению чувствительности выявления антител. При-, менение альдоенолдекстрана способствует образованию монослоя пептидов на планшете.

Иммобилизация пептидов на полистирол ьных планшетах. В работе использованы синтетические пептиды, синтезированные в Институте биоорганической химии им. Шемякина (H1V1LAVEL1, 41H1V 2 ROD, 41H1V1 ЕЗ), соответствующие антигенным детерминантам поверхностных белков ВИЧ 1 и ВИЧ II.

Используют планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения (ТУ 64-2-375-86, производство Ленинградского завода медицинских полимеров).

Планшеты активируют 0,1-0,01 %-ным водным раствором глутарового альдегида при в течение 30 мин. После отмывки от избытка альдегида боратным буфером рН 7,5-8,5 в лунки планшет вносят альдоенолдекстран с концентрацией 1-4 мкг в 1 мл боратного буфера. Выдерживают 3 ч при 37°С. Затем отсасывают жидкость из лунок планшет насосом и добавляют либо в смеси (1:1:1), либо в отдельности пептиды в концентрации 1-4 мкг на 1 мл боратного буфера рН 7,5-8,5. Реакцию ковалентного присоединения пептидов с альдоенолдекстраном, связаны с активированным полистиролом, проводят при 40-60°С в течение 20-24 ч. Отмывают боратным буфером с добавлением твина. Отсасывают жидкость насосом и подсушивают планшеты 1,5-2 ч при 37°С.

Реакция выявления антител ВИЧ. Постановку реакции осуществляют с сывороткой из свежей негемолизированной крови. Перед постановкой иммуноферментного

анализа планшеты однократно промывают боратным буфером. Иммуноферментный анализ на планшетах, полученных по предлагаемому способу, проводят согласно инструкции по применению иммуноферментной системы для

0 определения антител к вирусам иммунодефицита человека. Измерение оптической плотности производят спектрофотометрически при длине волны 492 нм непосредственно в планшетах на приборе МР-700 MIcroplate

5 Reader.

В табл.1 приведены данные по ковалентному связыванию пептидов по отдельности и в смеси с полистиролом предлагаемым способом. Концентрация пептида и альдое0 нолдекстрана 4 мкг/мл. Реакцию связывания пептидов с полистиролом проводят при рН 8, 16 при 60°С. Как видно из представленных данных пептиды как в смеси, так и в отдельности, нанесенные на планшеты, дают приблизительно одинаковую чувствительность метода анализа, несколько хуже работает планшета с пептидом H1V1 LAVELI.

Чувствительность определения антител

0 в результате иммобилизации пептидов.

В табл.2 представлены данные анализа антител к ВИЧ с помощью планшет, полученных предлагаемым и известным способами.

5 Чувствительность и специфичность определения антител.

Как видно из представленных данных при использовании планшет, полученных предлагаемым способом, чувствительность

0 анализа антител к ВИЧ возрастает в 10-20 раз по сравнению с известным. Ф о р м у л а и 3 о б р е т е н и я Способ получения диагностикума для выявления антител к ВИЧ путем связывания

5 синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам белков ВИЧ I и ВИЧ И, с полистирольной матрицей, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности определения, полистирольную матрицу предварительно активируют 0,01-0,1 %-ным водным раствором глутарового альдегида при 37°С в течение 20-30 мин, активированную матрицу обрабатывают раствором альдоенол5 декстрана с концентрацией 1-4 мкг/мл при рН 7,5-8,5 и 37°С в течение 3 ч, а связывание матрицы с пептидами осуществляют при рН 7,5-8,5 и 40-60 С путем обработки матрицы раствором пептидов с концентрацией 1-4 мкг/мл в течение 20-24 ч.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных аутоиммунных заболеваний. Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности определения. Для этого полистирол активируют 0.1-0,01 %-ным водным раствором глутарово- го альдегида в течение 20-30 мин при 37°С, затем к активированному полистиролу присоединяют альдоенолдекстран в концентрации 1-4 мкг/мл при рН 7,5-8,5 и 37°С в течение 3 ч и осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1-4 мкг/мл с альдо- енолдекстраном при рН 7,5-8,5, 40-60°С в течение 20-24 ч, 2 табл.(/) С

Таблица 2