Способ определения фибронектина Советский патент 1985 года по МПК G01N33/50 

со

00

и

1

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинике для определения дефицита фибронектина в биологических жидкостях организма, выявления гипер- фибронектинемии, а также для количественного определения фибронектина в процессе его промьшленного производства.

Известен способ определения фибронектина с помощью ракетного иммунофореза, предусматривающий нанесение контрольного и исследуемого образца в лунки пластин из геля агарозы, содержащей антитела к фиб- ронектину, и осуществление эдектрофореза в течение 12-16 ч при . После ЭТОГО гели отмывают 3-4 дня, высушивают, окрашивают, измеряют вы соту образовавшихся ракет и по высоте определяют содержание фибро- нектина

Недостатками указанного способа являются длительность определения и низкая производительность (не более 20-25 анализов в день). Кроме того, этим способом определяют только сз ммарный фибронектин без учета его биологической активности, характеризующей состояние факторов неспецифической защиты организма.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения фибро- нектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, представляющим собой бактериальные клетки, обработанные глутаровым альдегидом и О,1-0,5%-ньм раствором желатина, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибро- нектина по агглютинации, осуществляемым визуально или путем микроскопи рования .2,

Чувствительность определения 0,125 мкг фибронектина, при этом определяется фибронектин, сохранивший биологическую активность, т.е. способность связываться с желатином

Недостатком способа являетсяневысокая точность определения, обусловленная тем, что при постановке, агглютинационной пробы готовят ряд разведений исследуемой сыворотки (1:1-1:356) и оценку результатов осуществляют путем визуального наблюдения или с помощью микроскопи87422

рования, что не исключает субъективной оценки.

Точность и воспроизводимость определения фибронектина зависит 5 также от свойств и спецификации применяемого иммуносорбента, полученного на основе бактериальных клеток.

Целью изобретения является повы- 10 шение точности способа при определении биологически активного фибрО нектина.

Указанная цель достигается тем, . что согласно способу определения J5 фибронектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим, определением сврзав- шегося с сорбентом фибронектина, 20 причем в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором при 8,0-10,0, взятого в концентрации 10-12 мкг/мл.

Это позволяет не только коли- 5 чественно определить фибронектин,

обладающий биологической активностью, но и значительно повысить точность определения за счет использования сорбента, обладающего заранее за- Q данными, стандартными свойствами, что создает реальные предпосылки для автоматизации определения.

Определение связавшегося с сорбентом фибронектина можно осуществлять иммуноферментным методом.

Способ обычно осуществляют следующим образом.

Полистирол при рН 8,0-10,0 обрабатывают раствором желатина при концентрации 10-12 мкг/мл в течение 15-24 ч при 4°С. Полученный иммуносорбент многократно отмывают водой с 0,05% Твин 20, затем наносят образцы плазмы крови и инкубируют их 30 мин при . После отмывки несвязавшихся белков на образовавшийся комплекс полистирол-жела- тин-фибррнектин наносят антитела к фибронектину, ковалентно связанные с ферментом, инкубируют 30 мин при 37°С, отмывают, добавляют соответствующую субстратную смесь и по интенсивности окраски определяют содержание фибронектина в исследуемой пробе.

5 Предлагаемым способом можно определить биологически активный фибронектин в количестве от 5 до 800 иг/мл. Время проведения анализа не превьш1ает

1,5-2 Ч-, если учесть, что полисти- роловые плашки или пробирки можно заранее обрабатывать желатином и хранить до использования.

Пример . В лунки нового титровального планшета ;5ля серологических реакций заливают по 200 мкл раствора желатина в карбонатном буфере рН 9,6 (содержание белка 10 мкг/мл). Планшет инкубируют в течение 24 ч при , затем многократно отмывают водопроводной водой с 0,05% Твин 20 и вносят в лунки по 200 мкл исследуемых образцов плазмы крови, разведенных 1:1000 фосфатно-солевым буфером рН 7,2. Образец инкубируют в лунках в течение 30 мин при , Лунки снова отмывают и в каждую добавляют по 200 мкл конъюгата противофибронектиновых антител с пероксидазой, разведенного 1:2500. Конъюгат инкубируют 30 мин при , затем отмьшают лунки и каждую лунку заполняют

200 мкл субстратной смеси, состоящей из 0,0015%-ного раствора с 0,01% ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере; рН 4,7, После инкубации в течение 10 мин при 37 С реакцию останавливают добавлением в лунки 501 мкл 50%-ной серной кислоты. Интенсивность развившейся, окраски субстратной смеси измеряют фотометрически при / - 492 им.

Предлагаемый способ прост и доступен для освоения. Используя заранее заготовленные микротитровальные

планшеты, обработанные желатином, можно провести определение за 1,52 ч, что позволяет отнести предла- raeMbrii cnoco6 к методам экспрессанализа.

Следует отметить также возможность унификации предлагаемого способа, его высокую чувствительность и точность.

СПОСОБ ОПРЕДЕЖНИЯ ФИБРОНЕКТИНА путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина, отличающий тем, что, с целью повышения точности способа при определении биологически активного фибронектина, в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором желатина при рН 8,010,0, взятого в концентрации 10 12 мкг/нл. W