Способ регенерации растений люцерны из клеток Советский патент 1980 года по МПК A01H3/00 

(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ ИЗ КЛЕТОК3кого состава и одновременное оздорЪвление исходного мйтерйала от ба тёрйальной, грибной и вирусной инфекций. Поставленная цель достигаетШ тёк, что в качестве агаризованной питательной среды используют агаризбвйннуго среду Гамборга В с повышенным содержанием железа ( Ц ) сернокислого и трилона б , после образования каллусов последние помещают в жидкую среду Гамборга Вд , в которую, в качестве фитогормонов вводят 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензилаййнбпурйн, а полученные суспензии клеток переносят в Ясидкую среду Гамборга Вд без фитогор монов и пересаживают образовавшиеся из клеток эмбриоиды на агаризованную среду Гамборга Bj без гормонов. Способ осуществляется следующим образом.t Листочки , т.е. пластинки тройчатого листа, культивируемьос сортов и гибридов люцерны стерилизуют в О,1%-ном водном растворе дйоциДа и после трех кратной промывки в стерильной дистйлл рованной воде делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на основную питательную среду Гамборга Б , в которую дополнительно вводят 6ООО-800О мг/л бактоагара и 20Й-ЗОО мг/л нитрата аммония ; содержание сахарозы увеличивают до2500О-35ООО мг/л, железа ( и ) сернокислого FeSO -PHjO до 70-too мг/л, трилона Б до 9О-13Ом и вносят следующие фитогормоны: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д 8-16 мг/л, кинетйн 6-1О мг/л и -нафтилуксусную кислоту (НУК) О, l-OjS мг/л, рН срёдЫ доводят до 5,8-6,0« Состав среды предстаШён Ййнсб МакроэлементыСодерЯсани --- : - .мг/л ISO (NH)2S04 М@ЗОд-7Нз,0 CaCaj, 150 fFeSO -PHjO 28 37 l Трилон Б Микроэлементы 3 . 2 ZLnSO PHjO 0,25 Ыа.2.МоОд-ЗИгО 0,Ш CoCe.26MjO 0,02 KJ 0.75 Витамины Никотиновая кислота1 Тиамин-НСй :10 Пиридоксин-НСеI Миойнозит1ОО Сахароза2ОООО рН среды5,5 Материал инкубируют 2-3 недели при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 0,54,0 тыс. лк), температуре 26 t и относительной влажности 95-100% в закрытьсхпрозрачных сосудах. В случае появления на листочках бак-. териальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды, вирусная инфекция устраняется под воздействием фитогормонов. Через 2-3 .недели развившиеся каллусы переносят на ту же питательную среду, но без бактоагара, нитрата аммония, кинетина и НУК, содержание железа (f сернокислого и трилона Б .уменьшают до 28 к 37 мг/л соответственно (т.е как в среде В ), содержание 2,4-Д уменьшают до 0,1-0,2 мг/л и вводят дополнительно фитогормон - бензйламинопурин (БАП) 0,1-0,2 мг/л. Материал инкубируют 1-2 недели в закрытых прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом колебаний 1ОО-125 мин, при тех же параметрах освещенности, температуры и влажности, которые используют при инкубации листочков. Об- разовашиёся суспензии клеток субкульти-у вируют каждые две недели путем добавления к 4-6 объемам свежей среды того же состава 1 объема суспензии. Для получения регенерантов к 4-6 объемам свежей среды того же состава, но без фитогормонов добавляют 1 объем суспензии клеток и инкубируют в тех же условиях.. Через .1-2 недели образовавшиеся из клеток зеленые эмбриоиды (соматическйе зародьпци) переносят на агаризованную среду Гамборга By без гормонов. Условия инкубации остаются прежними, но длину фотопериода сокращают до .16 ч в 1 сут. По мере развития растений на этой среде и появления у них двух-трех тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву и вьфащивают в обычных условиях. Работу, свазанную со стерилизацией листьев, субкультивированием суспензий ,