Штамм @ @ ИФРЖЗ-продуцент биологически активных веществ женьшеня и способ получения биологически активных веществ Советский патент 1984 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к химико-ф мацевтической промьшшенности и може быть использовано в косметической промьгашенности в качестве активных компонентов кремов, лосьонов, а так же в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок. Известен способ получения солонинсодержащих биологически активных препаратов при культивировании клеток женьшеня на питате;льной сре де сложного состава 1 , Известен штамм Рапах ginseng ИФРЖ1-продуцент биологически активны веществ женьшеня и известен также способ получения биологически активных веществ путем культивирования штамма-продуцента на питательной ср де, содержащей, мг/л воды: NH4N03 KNO MgS047H20370 КНгРО 170 Н.ВОз6,20 MnS044H2022;80 ZnS.04-7H O8,60 ,83 Na2Mo04-2H.20 0,25 CuSO. 5Hr,0 FeS04-7H,,027,80 Na ЭДТА 37,30 (натриевая соль этилендиамиктетраук суснон кислоты), тиаминбромид (В) 0,40, оС-нафтилуксусиая кислота (НУК) 2, кинетин 1, инозит 80, гидролизат казеина 500, сахароза 3 10 агар-агар 7-10 2. Однако известные технические реш ния не обеспечивают высокой биологи ческой активности целевого продукта Целью изобретения является повьш иие биологической активности целево го продукта. Поставленная цель достигается те что при осуществлении способа получ ния биологически активных веществ, предусматривагацем выращивание штамм продуцента на питательной среде, со держащей микро- и макросоли, стимул торы роста, сахар и агар-агар с пос дующим вьщелением целевого продукта отличием является то, что в качеств продуцента используют штамм Panak g seng ИФРЖЗ, а выращивание ведут на среде, содержащей,.мг/л воды: 1145-1850 .KNOi.1490-2100 CaCl2 2Н20 520-500 MgS04 7H20 350-400 KHjPO 150-210 4,2-8,0 MnSO -4H20 15,6-26,7 ZnS04.7H.O 6,0-10,3 KJ 0,53-0,90 Na2Mo042H20 0,15-0,30 CuSO,-5H20 0,03-0,075 CoCl2-2H20 0,03-0,075 FeSO. 7H,0 25,0-30,0 Na2 ЭДТА 26,1-40,1 Тиаминбромид (B)0,4Qr0.80 Сахар 2,,5,-10 Агар-агар 6,10-710з Для осуществления способа, предложен штамм Рапох ginseng ИФРЖЗ (коллекционньш номер 2) - продуцент биологически активных, веществ, которые связаны между собой единым изобретательским замыслом. Штамм Рапах ginseng ИФРЖЗ получен в Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева и хранится в коллекции культур растительных клеток данного института под номером 2. Штамм характеризуется следующими признаками. Штамм представляет собой светложелтую, рыхлую, крупно-зернистую клеточную массу со специфическим запахом и вкусом. Популяция состоит.на 52-80% из клеток меристематического типа (с размером от 29,5 до 109,2 мкм) и на 7-26% из клеток паренхимного типа (с размером от 67,2 до 277,2 мкм). Лигнификация составляет до 35% с образованием трахеальных узлов. Ткань, растущая на среде, из состава которой исключены регуляторы роста - кинетин и об нафтилуксусная кислота, гидролизат казеина, инозит, имеет ростовой индекс 76,0-13,О и содержит 4,2-4,6% сухого вещества. Цикл выращивания характеризуется S-образной кривой с лагфазой до . сут, фазой экспоненциального роста (6-12 сут), линейной фазой (12-30 сут), фазой замедления роста (30-33 сут) и стационарной фа- ЗОЙ (33-35 сут)4 Кривая митотической активности имеет двувершиннЕлй характер с максимумом. в первую и вторую недели. Среднее число хромосом 105,41 J.0s,0 с вариадае от 28 до 400. Использование штамма ИФРЖЗ в каестве продуцента биологически активых веществ женьшеня и способа получения биологически активных веществ иллюстрируется следующим примером, П р и. м е р 1. В колбы Эрленмейе емкостью 250 кш разливают по 90 мл предлагаемой питательной -среды еледующего состава, мг/л среды: 1145-1850 NH4N03 1490-2100 . 420-500 CaClj.2Н20 350-400 MgSO 150-210 КН7Р04 4,2-8,0 НзВОз 15,6-26,7 6,0-10,3 . 0,53-0,90 0,15-0,30 -21120 0,03-0,075 CuSO 5H20 0,03-0,075 CoClj-bHjO 25,0-30,0 7H 0 26,1-40,1 Na ЭДТА Тиаминбромид 0,40-0,80 2,,510 Caxap 6-103-7-10 Агар-агар при рН 5,8 закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре 120с в течение 15 мин. После стери лизации содержимое каждой колбы раз вают в стерильных условиях по.30 мл в три чашки Петри диаметром 120 мм. После застывания и охлаждения аг ; ризгованной питательной среды на ее поверхность помещают по 5 инокулято ткани штамма Рапах ginseng ИФРЖ 1 в . сом 100 мг каждый, из коллекции лаб .ратории культуры ткани и морфогенез Института физиологии растений .. . им.К.А.Тимизярева АН СССР. Чашки Пе ри с инокулятами заклеивают лентой Parafilm и инкубируют при температу 26 С н относительной влажности возд ха 70%. Каждый цикл выращивания сос тавляет 33 сут. В отсутствии обоих фитогормонов (с -нафтилуксусная кисл та и кинетин) ткань заметно угнетае ся в росте и к концу первого пассажа ее вес составлял лишь 15% от ткани с Известной средой (см.табл.1). Сравнение биомассы штамма ИФРЖ 1 выращенного на известной и предлагаемой средах. Отсутствие обоих фитогормонов было лимитирующим фактором: на ткани .появляются некротизированные участки отмеченные синтезом антоцианов, она темнеет а во втором пассаже наступает ее гибель. Однако на фоне общей гибели удалось отобрать 3 колонии елящихся клеток. При дальнейшем пассировании сохранилась лишь .одна из трех колоний, в которой при .дальнейших пересадках интенсивность роста клеток увеличилась. Определение частоты возникновения протогрофной по итогормонам линии (610 ) и .длительное сохранение прототрофности в селективных условиях показывает, что отобранная линия является результатом мутационного изменения. Полученный штамм ИФРЖЗ нормально растет 30 пассажей на предложенной среде, рост не уступает ткани исходного дикого штамма женьшеня ИФРЖ 1, из которого она была.выделена (см.табл.2). Сравнение биомассы штаммов ИФРЖ 1 и ИФРЖЗ, выращенного на известной и предложенной средах. По истечении цикла выращивания выросшую биомассу 14,00 г отделяют от агара, и высушивают при температуре . Высушенная ткань измельчается до размера частиц 0,05-0,1 мм и используется в качестве целевого продукта. Получение биологически активных .веществ. В перколятор (1,0 л) помещают 100 г измельченной сухой биомассы штамма ИФРЖ 3 и заливают 500 мл 30%ного этанола до образования зеркального слоя под сырьем и оставляют на срок до 24 ч. По истечении указанного срока экстракт перкалируют со скоростью 5 мл/мин с одновременным поступлением на сьфье 35%-ного этанола с такой же скоростью. Экстракцию продолжают до получения 1 л настойки. Полученную настойку отстаивают в течение 2 дней, фильтруют и используют до назначению в качестве целевого продукта. Фармакологические испытания биологически активных веществ из штаммов ИФРЖ1 и ИФРЖЗ проводились иа нелинейных мьш1ах-самцах. Результаты представлены в табл.3. При использовании биологически активных веществ из штамма ИФРЖ 3 установлено, что этот препарат увеличивает стимулирующий эффект на животных, повьшая их работоспособность по сравнению с контрольным препаратом на 15% (табл.3). Кроме того, дозы, вызывающие этот эффект, были в 2 раза еньшими, чем у контрольного препаата. Отсюда количество СЕД , по оторым можно судить о биологической активности сырья, в 2 с лишним раза

5.1058282

выше у предлагаемого препарата, чем контрольного и составляет 224.единицы. Применение нового штамма-продуцен та ИФРЖЗ биологически активных не- 5 ществ панаксозидов женьшеня и способа получения паьаксозидов позволяет повысить выход биологически активных веществ за,.счет повьппения выхода биомассы, уменьшить на 39% затраты по 0 Получению 1 кг сухой биома:ссы Женьше- ИФР ня по сравнении) с известной средой и улучшить фармакологические свойства целевогоп бдукта.. . 15 Таблица 1

Таблица 2 ИФР Сра Ж 1 Ийвест14,,68 ная ПредЖЗлагае14,0610,63 мая - .Таблица 3 внение биологической активности штаммов ИФРЖ1 и ИФРЖЗ

1. Штамм Рапах ginseng ИФРЖЗ, № 3, № 2 (хранится в коллекции культур растительных клеток Институтафизиологии растений им.К.А.Тимирязева АН СССР) - продуцент биологически активных веществ женьшеня. 2. Способ получения биологически активных веществ путем выращивания .штамма-продуцента на питательной cpe-i де, содержащей микро- н макросоли, стимуляторы роста, сахар и агар-агар с последукяцим выделением целевого продукта,отличающийся тем, что, с целью повышений биологической активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Рапах, ginseng ИФРЖЗ, и выращивание ведут на среде, содержащей, мп/л воды: 1145-1850 NH4N03 1490-2100 ICNOj 420-500 CaClj- 2Н20 350-400 MgS04-7K20 150-210 KH-jPO 4,2-8,0 g 15,6-26,7 MnS044H20 tn с 6,0-10,3 Zn04-7H O 0,53-0,90 KJ NajMoO 0,15-0,30 )2H20 0,03-0,075 CuSO 4- 5H20 0,03-0,075 CoClg- 2H20 FeS04-7H20 25,0-30,0 ел 26,1-40,1 Naj ЗДТА 00 ТиаминброМКД (B) 0,40-0,80 INO 2,5М04 -3,5-10 Сахар 00 1C 6, 10 Агар-агар

ИФРЖ1 Известная. ЮО 1,9610,07 11ФРЖ1 Предлагаемая 100 0,3010,01

контрольных и опытных животных,

%,

Условная стимулирующая единица действия, обеспечивающая повышение работоспособности на 33% от 1 г сырья.