Питательная среда для культивирования штамма РSеUDомоNаS SтUтZеRI ВКПМ В-4724 - продуцента рестриктазы PS и 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12N9/22 C12N1/20 C12R1/38 

1

(21)4724816/13

(22) 27.07.89

(46) 15.12.91. Бюл. №46

(71)Научно-производственное обьединение Биолар и Научно-производственное обьединение Вектор

(72)Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин, С.Х.Дегтярев и Н.В.Бойкова

(53)577.15(088.8)

(56)Аркадьева З.А., Трифонова Т.В./Агапова Н.С. и Козлова Е.И. - Научн. докл. высшей школы биол. науки, 1976, №7, с. 113-115.

Gingeros T.R., Greenough L, Lehildkraut I., Roberts RJ. Two new restriction endonu- cleases from Protew vulgaris. - J. Nucleic Acids Res., 1981, vol. 9, № 18, p. 4525-4536.

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА PSEUDOMONAS STUTZERI ВКПМ В-4727 - ПРОДУЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ PSU

(57)Изобретение относится к микробиологии и касается состава питательных сред,

предназначенных для культивирования продуцентов растриктазы Psu I. С целью повышения выхода фермента и его активности предлагают использовать для выращивания продуцента рестриктазы Psu I - Pseudomonas stutzeri ВКПМ-4727 питательную среду, содержащую в качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат с содержанием, %: общий азот 11,2;аминный азот 6,7; зола 9,7; влажность 4,1, при следующем соотношении компонентов, г/л: панкреатический почечный гидролизат 15,0- 20,0; аммоний сэрнокислый 1,0-2,0; натрий лимоннокислый 0,5-0,7; хлористое железо 0,001-0,002; вода до 1 л. При этом выход биомассы достигает 12,5-13,0 г/л культу- ральной жидкости, выход рестриктазы 10000-15000 ед./г биомассы, а активность увеличивается до 125000-195000 ед./л куль- туральной жидкости, что в 2-5 раз превышает аналогичные показатели на известной среде. 1 табл.

(Л

С

Изобретение относится к микробиологии, в частности к составам питательных сред, предназначенных для культивирования продуцентов рестриктазы PSU I.

Цель изобретения - повышение выхода фермента и его активности.

Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда для культивирования продуцента рестриктазы - штамма Pseudomonas stutzeri ВКПМ 8-4727 содержит в качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат и минеральные соли.

о ю

Панкреатический почечный гидролизат производят путем ферментативного гидролиза отходов (в данном случае почек живо- тных) с последующим высушиванием на распылительной сушилке.

Панкреатический почечный гидролизат представляет собой порошок светло-коричневого цвета. Он богат важными жизненно необходимыми элементами для нормального роста, развития бактерий, проявления биосинтетической активности

Почечный гидролизат содержит, % общий азот 11,2; аминный азот 6,7 зола 9,7; влажность 4,1. Кроме того, так как в почках

К)

со о

животных содержатся и другие биологически активные вещества (витамины, микроэлементы и др.), то при приготовлении гидролизата, он обогащается этими веществами.

Введение панкреатического почечного гидролизата способствует активизации роста, стимулированию жизнедеятельности бактерий и накоплению рестриктазной активности.

Введение сернокислого аммония способствует дополнительному питанию бактерий аминным азотом и серой. В качестве источника углеродистого питания в питательную среду вводят лимоннокислый натрий В результате совместного использования лимоннокислого натрия и сернокислого аммония происходит поддержание рН во время выращивания культуры в оптимальных пределах (7,2). Ионы натрия совместно с ионами железа, входящими в состав хлорида железа, воздействуют на дыхательные центры бактерий.

При введении пакреатического почечного гидролизата в количествах менее 15,0 г/л (например, 12,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так-как не хватает амин- ного азота для роста и развития бактерий Pseudomonas stutzeri и, соответственно, для биосинтеза рестриктазы Psu I. При введении панкреатического почечного гидролизата в количествах более 20,0 г/л (например, 2,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так как происходит репрессия роста бактерий и биосинтеза рестриктазы Psu i.

При введении сернокислого аммония в количествах менее 1,0 г/л (например, , 0,5 г/л) происходит снижение выхода биомассы и рестриктазы Psu , так как количества ионов аммония не достаточно для подщелачивания среды и поддержания рН. При введении сернокислого аммония в количествах более 2,0 г/л (например, 2,5 г/л) снижается выход биомассы и рестриктазы Psul, так как происходит инги- бировэние роста бактерий и биосинтеза фермента.

При введении лимоннокислого натрия в количествах менее 0,5 г/л (например, 0,4 г/л) происходит снижение выхода биомассы бактерий и рестриктазы Psu I вследствие того, что не хватает ионов натрия в среде для активации клеточного дыхания бактерий. Введение лимоннокислого натрия, в количествах более 0,7 г/л (например 0,8 г/л) вызывает снижение выхода биомассы бактерий и рестриктазы Psu гак как происходит ингибирующее воздействие на дыхательные центры клеток.

Введение хлорида железа.в количествах менее 0,001 г/л (например, 0.0005 г/л) приводит к снижению выхода биомассы и рестриктазы Psu I, так как не хватает ионов железа в среде для активации клеточного дыхания бактерий и ионоз хлора для питания культуры. При введении хлорида железа в количествах более 0,002 г/л (например, 0,0025 г/л) происходит снижение выхода 0 биомассы бактерий и рестриктазы Psu I вследствие того, что происходит репрессивное воздействие на дыхательные центры и избыток ионов хлора ингибирует рост, развитие и биосинтетическую активность куль- 5 туры,

П р и м е р 1. Питательная среда содержит, г/л:

Панкреатический почечный

гидролизат20,0

0 Сернокислый аммоний2,0

Лимоннокислый натрий0,7

Хлорид железа0,002

ВодаДо 1,0 л

Оживление штамма Pseudomonas 5 stutzeri 131 ВКПМ В-4727 осуществляют на сухом питательном агаре (сухой питательный агар 35,0 г/л; вода 1,0 л) в чашках Петри. Инкубируют в термокамере при 28°С в течение 24 ч,

0 С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей о качзлочные колбы с питательной средой данного состава, рН 7,2.

Выращивают посевной материал при 5 28°С в течение 18 ч на качалке.

Ферментацию культуры проводят на питательной среде данного состава при рН 7,2, температуре 28°С, перемешивании 200 об/мин, подаче воздуха: 2 объема воз- 0 духа на 1 объем питательной среды, выращивают до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,7 опт.ед. (ФЭК, фильтр № б, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 13,0 г/л культуральной 5 жидкости

Выход рестриктазы Psu 15000 ед,/г биомассы; 195000 ед./г культуральной жидкости.

Для определения активности фермента 0 используют метод электрофореза в геле.

Активность фермента определяют в

грубом экстракте биомассы бактерий

Pseudomonas stutzeri 131 ВКПМ В-4727 и

в конце выделения (после хроматографии на

55 колонке с фосфоцеллюзой).

За единицу активности рестриктазы Psu I принимают минимальное количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 37°С.

Выделение фермента проводят следующим образом.

50 г биомассы бактерий Pseudomonas stutzeri суспендируют е 100 мл 10 мМ трис- HCI-буфера, рН 7,2, содержащего 10 мМ 2- меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия, 1 мМ трилона Б (буфер А), и доводят этим же буфером до обьема 150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мл 10%-ного,тритона Х-100 и 150 мгл лизоцима. Лизис проводят 1 ч при постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизатз проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лизат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного водного раствора, полизтиленгликоля (ПЭГ) и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают а течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге Hlqh speed (20000 g 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным объемом буфера А, добавляют тритон Х-100 (0,1%-ный) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1%-ный тритон X- 100 (буфер Б). Фермент элюируют 0-1,0 М линейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Psu i, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55%-ный глицерин.

Получают очищенный фермент Psu I в виде прозрачной бесцветной жидкости.

Рестриктаза Psu I расщепляет ДНК фага А на 3 сайта.

Содержание неспецифических экзо- и эдонуклеаз: после выделения отсутствуют. Хранят рестриктазу Psu i при -10°С в течение 1 года.

П р и м е р 2. Питательная среда, содержит, г/л:

Панкреатический почечный гидролизат17,5

Сернокислый аммоний1,5

Лимоннокислый натрий0,6

Хлорид железа0,0015

ВодаДо 1,0 л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 12,75 г/л культураль- ной жидкости.

Выход рестриктазы Psul 12500 ед./г биомассы; 160000 ед./л культуральной жидкости. Определение активности, выделение фермента Psu i и хранение осуществляют аналогично примеру 1.

П р и м е р 3, Питательная среда содержит, г/л:

Панкреатический почечный гидролкзат15,0

5Сернокислый аммоний1,0

Лимоннокислый натрий0,5

Хлорид железа0,001

ВодаДо 1,0 л

Выращивание биомассы: адаптацию 10 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1,

8ь ход биомассы 12,5 г/л культуральной жидкости.

15 Выход рестриктизы Psu I 1COOO ед./V биомассы; 125000 ед./л культуральной жидкости.

Определение активности, выделени; фермента Psu I и хранение осуществляют 0 аналогично примеру 1.

П р и м е р 4. Питательная среда содержит, г/л:

Панкреатический почечный гидролиэат12,5

5Сернокислый аммоний0,5

Лимоннокислый натрий0.4

Хлорид железа0,0005

ВодаДо 1,0 л

Выращизание биомассы: адаптацию 0 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 5,1 г/л культуральной жидкости.

5Выход рестриктазы Psu I 2300 ед./г био-массы; 11730 ед./л культуральной жидкости. -Определение активности, выделение фермента Psu I и хранение осуществляют как в примере 1.

0П р и м е р 5. Питательная среда содержит, г/л:

Панкреатический почечный гидролизат22,5

Сернокислый аммоний2,5

5Лимоннокислый натрий0,8

Хлорид железа0,0025

Вода До 1,0 л

Выращивание биомассы: адаптацию . культуры, инокуляцию посевного материа- 0 ла, ферментацию культуры проводят как в примере 1.

Выход биомассы 5,7 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Psu I 3100 ед./г 5 биомассы.

Определение активности, выделение фермента Psu I и хранение осуществляют как в примере 1.

Примерб. В таблице представлены данные по сопоставительному анализу выращивания штамма продуцента Pseudo- monas stutzert ВКПМ В-4727 на известной и предлагаемой средах.

При выращивании на предлагаемой среде продуцента рестриктазы Psu I - Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 выход биомассы бактерий возрастает в 2 раза, а выход и активность рестриктазы увеличиваются в 3-5 раз по сравнению с известной средой,

Формула изобретения Питательная среда для культивирования штамма Pseudomonas stutzer ВКПМ В- 4727 - продуцента рестриктазы Psu I, включающая источник аминного азота, миПитательная среда

Известная

Содержание, г/л

Пептон 10,0

Хлористый натрий 5,0

Мясная вода 1,0 л

Выход биомассы

Ь,3 г/л культуральной жидкости

Выход рестриктазы

6000 ед./г биомассы;

37800 ед./л культуральной жидкости

0

5

неральные соли и воду, о т ли чающая- с я тем, что, е целью повышения выхода фермента и его активности, в качестве источника аминного азота среда содержит панкреатический почечный гидролизат. а в качестве минеральных солей - сернокислый аммоний, лимоннокислый натрий и хлористое железо при следующем соотношении компонентов, в г/л:

Панкреатический почечный гидролизат15,0-20,0

Аммоний сернокислый1.0-2,0

Натрий лимоннокислый0,5-0,7

Хлористое железо0,001-0,002

ВодаДо 1 л

Предлагаемая

Панкреатический почечный гидролизат 20

Сернокислый аммоний 2,0

Лимоннокислый натрий 0,7

Хлорид железа 0,002

Вода 1,0 л

12,5-13,0 г/л культуральной жидкости

10000-15000 ед./г биомассы; 125000-195000 ед./л культуральной жидкости