Способ определения активности фитоадаптогенов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам оценки эффективности лекарственных средств, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается путем определения влияния водного раствора сухого остатка на показатель скорости медленной вспышки Fe -индуцированной хемилюминесценции (ХЛ).

Способ осуществляют следующим образом.

5 мл спиртового раствора выпаривают досуха при , разводят в 1 мл дистиллированной воды. Изучают следующие разведения препаратов: 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:20; .4Q: 1:80; 1:100; 1:200 с целью выявления

степени ингибирования ими перекисного окисления липидов (ПОЛ). Эффективными являются разведения, ингибирующие ПОЛ на 50%. Для настойки аралии такое разведение составляет 1:4, для экстракта элеутерококка- 1:20, для настойки женьшеня- 1:2 (содержание сухих веществ в ячейке составляет 0,2 мг BI мл суспензии для всех вышеуказанных препаратов в данных разведениях). Остальные разведения изучаемых препаратов либо вызывали полное ингибирование ПОЛ, либо давали результаты, достоверно не отличающиеся от контроля. Суспензию готовят из желтка куриных яиц путем перемешивания его с фосфатным буфером (20 мл KHzPO/i, 105 ммоль KCI. рН 7,4) в соотношении 1:1 на магнитной мешалке со скоростью 500 об/мин в течение 10 мин. 1 мл липосом помещают в термостатируемую кювету (при 37°С), которую устанавливают в светонепроницаемой камере над торцом фотоэлектронного умножителя ФЭУ-39А-хемилюминометра. К липосомам добавляют 2,9 мл фосфатного буфера и 0,1 мл раствора препарата. После 3 мин инкубации при постоянном перемешивании содержимого при 380 об/мин открывают шторку, отделяющую дно кюветы от торца ФЭУ, регистрируют исходный уровень ХЛ, после чего в ячейку вводят 1 мл 10 М раствора FeSO/1 с последующей регистрацией всех стадий ХЛ (быстрая вспышка, латентный период, медленная вспышка). Таким образом оценивается действие всех указанных выше разведений препаратов, концентрация сухого остатка в которых была известна. Рассчитывают скорость медленной вспышки ХЛ, измеренную как tg угла наклона начальной экспоненциальной части медленной вспышки.. рассчитывают коэффициент ХЛ, пропорциональный антиокислительной активности лекарственных препаратов: Кхл сГо/а

где оь tg угла начальной экспоненциальной части медленной вспышки ХЛ липосом без препарата,

(7- tg угла наклона начальной экспоненциальной части медленной вспышки ХЛ липосом в присутствии препарата.

-П р и и е р 1. Настойка аралии ХФЗ 06.87, и настойка аралии МФ 06,87. Проведена сравнительная оценка адаптогенной активности на моделях гипоксической гипоксии, гипероксии и ишемии ЦНС и сердечно-сосудистой системы,у лягушек.

Гипоксическая гипоксия. Опыт проводили на белых беспородных мышах массой 20 г средней устойчивости к гипоксии. Предварительно в течение 2 дней мышам вводили по 0,1 мл водного раствора препарата внутрибрюшинно, контрольной группе вводили по 0,1 мл дистиллированной воды. На третий день (день эксперимента) препараты вводили за три часа до начала эксперимента. Гипоксическая гипоксия достигалась разряжением на высоте 11 км, подъем осуществляли в течение 110 с. Определяли срок гибели мышей.

Гипербарическая оксигенация. Эксперименты проводили на белых беспородных мышах массой 20 г. Предварительно в течение 2 дней мышам вводили по 0,1 мл водного раствора препарата внутрибрюшинно, контрольной группе вводили.такое же количество дистиллированной воды. На третий день (день эксперимента) препараты вводили за три часа до начала эксперимента,

Гипербарическую оксигенацию создавали в барокамере при 5 ати в течение 40 мин. Срок компрессии и декомпрессии равен 20 мин. Определяли время наступления судорог,

срок жизни в барокамере и процент гибели. Ишемия ЦНС и сердечно-сосудистой системы. Исследования проводили на лягушках-самцах (Rana temporaria) на ишемии ЦНС и сердечно-сосудистой системы, предложенной А. Н. Кудриным. Водные растворы препаратов вводили лягушкам в задний лимфатический мешок в течение 2 дней. В первый день препараты вводили дважды с интервалом в 3 ч. На второй день

(день эксперимента) препараты вводили за 3 ч до начала эксперимента. Контрольным лягушкам вводили в течение 2 дней по 0,1 мл дистиллированной воды. До начала введения препаратов лягушки сутки находились при комнатной температуре (+18°С) и далее во время эксперимента также находились при той же температуре. У лягушек прекращали кровообращение путем наложения лигатуры на дугу аорты. Затем фиксиревали сроки угасания простого рефлекса спинного мозга (вынимание лапки из 0,35%ного раствора серной кислоты). После прекращения рефлексов оставляли лигатуру на аорте в течение 20 мин (срок относительной

биологической смерти для ЦНС, после которого происходит самопроизвольное восстановление рефлексов). Затем проводили реперфузию ЦНС и всего организма вбзобновлением кровообращения путем снятия

лигатуры с дуги аорты и наблюдали за последующим восстановлением рефлексов ЦНС. Отмечали срок.восстановления простого рефлекса спинного мозга и процент гибели лягушек после реперфузии.

Для определения антиокислительной активности и расчета коэффициента ХЛ, пропорционального антиокислительной активности лекарственных препаратов, измеряли скорость медленной вспышки ХЛ

липосом при инкубации с водным раствором препарата, содержащим сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии. Определение проводили для двух серий настоек аралии (табл. 1). При определении коэффициента ХЛ настойки аралии ХФЗ 06.87. ао 1,51, значение а 0,76. Кхл оь/сг 1,51/0,,99, что выше нижнего уровня доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для настойки аралии. Это свидетельствует о выЬокой антиокислительной активности. При определении коэффициента ХЛ настойки аралии МФ 06.87. значение сГо 1,51, значение (7 1,42, Кхл ffo/o 1,61/1,,06, что ниже нижнего уровня

доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для настройки аралии (это свидетельствует о низкой антиокислительной активности).

Настойка аралии ХФЗ 06.87. обладает более высокой адаптогенной активностью при ишемии ЦНС лягушки, гипероксии, при отсутствии, достоверных различий между ними при гипоксической гипоксии. Коэффициент ) Л настойки аралии с высокой адаптогённой активностью составляет 1,9 и выше. Сухой остаток в настойке аралии ХФЗ 06.87, составляет 3,2 %, в настойке аралии МФ 06.87. -2,8%. Адаптогенная активность настойки аралии ХФЗ 06.87. отличается от настойки аралии МФ 06,87. по методике ишемии ЦНС лягушки соответственно на 33%, по значению коэффициента ХЛ - на 59,2%, то по сухому остат1 у - на 13%, что свидетельствует о том, что способ стандартизации по значению коэффициента ХЛ является более точным, чем прототип.

П р и м е р 2. Экстракт элеутерококка завод Санитас 12.84. и экстракт эл утерококка ХФЗ 12.86. Проведена оценка адаптогённой активности на моделях гипоксической гипоксии, гипероксии и ишемии ЦНС и сердечно-сосудистой системы у лягушек. Методики провождения идентичны для настойки аралии. Измеряли скорость медленной вспышки ХЛ при инкубации с водным раствором препарата, содержащим сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии. Определение проводили для двух серий экстракта элеутерококка (см. табл. 2). При определении коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка ХФЗ 17.86. Оо 0,77, значение о 0,3. Кхл оь/ст 0,77/0,,56, что выше нижнего уровня .доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка. Это свидетельствует о высокой антиокислительной активности. При определении коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка завода Санитас 12.84. значение СГо 0,77, значение о 0,7. Кхл оь/о 0,77/0,,1, что ниже нижнего уровня доверительного интервала значений коэффициента ХЛ для экстракта элеутерококка. Это свидетельствует о низкой антиокислительной активности.

Экстракт элеутерококка ХФЗ 12.86. обладает более высокой адаптогенной активностью при ишемии ЦНС лягушки, гипероксии, гипоксической гипоксии. Коэффициент ХЛ экстракта элеутерококка с высокой адаптогенной активностью составляет 1,9 и более. Сухой остаток в экстракте элеутерококка завода Санитас 12.84. равен 8,2%, в экстракте элеутерококка ХФЗ 12.86.-6,3%. Адаптогенная активность экстракта элеутерококка ХФЗ 12.86. отличается от экстракта элеутерококка завода Санитас 12.84. по методике ишемии ЦНС лягушки соответственно на 15,4%, значение коэффициента ХЛ - на 42,9%, по методике прототипа, содержание сухого остатка в экстракте элеутерококка завода Санитас больше на 23,2%. Это свидетельствует о том, что способ стандартизации с использованием коэффициента ХЛ является более точным, чем прототип..,

П р и м е р 3. Настойка женьшеня ХФЗ 10.84. и настойка женьшеня ХФЗ 08.87. Проведена сравнителная оценка адаптогенной активности на моделях гипоксической гипоксии и на устойчивость животных к повторным физическим нагрузкам. Методика проведения гипоксической гипоксии (см. пример 1).

Полученные результаты приведены в табл. 3.

Изучение влияния препаратов женьшеня на устойчивость животных к повторным физическим нагрузкам. В экспериментах были использованы белые беспородные мыши-самцы массой 18-25 г. Предварительно животные были подвергнуты отбору по показателям физической работоспособностиплавание до полного утомления в бассейне с постоянной температурой 25°С. Критерием отбора служила продолжительность плавания не менее чем 4 мин. При проведении исследований животным при первом плавании пре,цлагалась физическая нагрузка, составляющая 80% от максимальной. При повторном плавании, которое осуществлялось спустя 2 ч после завершения первого плавания, животные выполняли физическую нагрузку до максимального утомления. Критерием оценки эффективности препаратов служило увеличение длительности повторного плавания по сравнению с контролем. Для получения стабильных результатов и уменьшения разброса вариационного ряда экспериментальных данных животным подвешивали специально приспособленный груз, не затрудняющий движений и составляющий 5% от массы тела. Препараты вводили опытным животным в течение 7 дней, а в последний день за 1 ч до повторного плавания внутрибрюшинно в дозах 1-20 йл/кг. Контрольным животным в том же режиме внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в тех же объемах, что и опытным животнь1М. Продолжительность плавания животных регистрировали в секундах. Измеряли скорость медленной вспышки ХЛ липосом при инкубации с водным раствором препарата, содержащим сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии. При определении коэффициента ХЛ, пропорционального антиокислительной активности, для настойки женьшеня ХФЗ 08.87. значение С7о 1.09. значение сг 0,46. Кхл оь/а 1,09/0.,46, что выше нижнего уровня доверительного интерала значений коэффициента ХЛ. Это свидетельствует о высокой антиокислительной активности. При определении коэффициента ХЛ для настойки женьшеня ХФЗ 10.84 значение сго 1,09, значение ст 1,28. Кхл оь/сг 1,09/1,,85, что ниже нижнего уровня доверительного интервала значений коэффициента ХЛ. Это свидетельствует о низкой антиокислительной активности. Настойка женьшеня ХФЗ 08.87. обладает более высокой адаптогенной активностью при гипоксичёской гипоксии, устойчивости животных к повторным физическим нагрузкам. Сухой остаток настойки женьшеня ХФЗ 08.87. составляет 2,7%. а в настойке женьшеня ХФЗ 10.84.-2,4%. Адаптогенная активность настойки женьшеня ХФЗ 08.87. отличается от настойки женьшеня ХФЗ 10.84. по показателю их влияния на физическую выносливость (продолжительность повторного плавания) при дозе 5 мл/кг соответственно на 63,7%, по методу гипоксичёской гипоксии - на 33,5%, по значению коэффициента ХЛ - на 40,3%; а по методике прототипа содержание сухого осСравнительная оценка параметров хемилк)минесценции препаратов аралии при разведении 1:4

Таблица 1 татка отличается на 0,3%. Это свидетельствует о том, что способ оценки эффективности с использованием коэффициента ХЛ является более точным, чем прототип. Таким образом, результаты изучения влияния водного раствора на показатель скорости медленное вспышки Ре -индуцйрованной ХЛ Свидетельствует о том, что при значении коэффициента ХЛ для настоек аралии и женьшеня, а также экстракта элеутерококка выше 1,9 (при содержания сухих веществ в ячейке 0,2 мг в 1 мл суспензии) препараты обладают высокой адаптогенной активностью (табл. 4). Формул а изобретени я Способ определения активности фитоадаптогенов путем исследования сухого остатка раствора фитоадаптогена, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, исследуют влияние водного раствора фитоадаптогена на скорость медленной вспышки Ре .-иидуцированной хемилюминесценции, затем рассчитывают коэффициент хемилюминесценции, пропорциональный антиокислительной активности фитоадаптогена по формуле Кхл оь/а, где Ob-tg угла наклона начальной экспоненциальной кривой медленной вспышки хемилюминесценции липосом без препарата; cr-tg угла наклона той же кривой в присутствии исследуемого фитоадаптогена и при значений коэффициента хемилюминесценции выше 1,9, определяемой высокую адаптогенную активность препарата.

Сравнительная оценка параметров хенилйминесценции препаратов элеутерококка при разведении 1:20

,т а б л и ц а 2

Сравнительная оценка точности метода-прототипа и предлагаеного метода хемилюминесценции

Таблица

Изобретение предназначено для использования в химико-фармацевтической промышленности и'мeдvlцинe для определения активности фитоадаптогенов. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается за счет определения антиокислительной активности (АОА) препаратов. 5 мл исследуемого фитоадаптогена упаривают (до полного удаления спирта) до сухого остатка и далее готовят водный раствор с содержанием его в 1 мл не менее 10 мг и не более 12 мг, определяют влияние водного раствора на показатель скорости "медленной вспышки" Fe^^-индуцирован- ной хемилюминесценции (ХЛ), рассчитывают коэффициент ХЛ, пропорциональный АОА, и при значении этого коэффициента. ХЛ, находящегося в пределах более 1, ?fi определяют высокую адаптогенную активность препаратов. 4 табл.

Настойка женьшеня ХФЗОе.87 2j7 0,026940,0075 11,2±28 0, Настойка женьшеня ХФЗ 10.84 2,4 0,023Э±0,007 1,08iO,09 Настойка 0,0320±0,0065 12, 0, ХФЗ 06.87 3,2 Настойка аралии МФОб.е. 2,8 0,0279iO,007 Экстракт элеутерококка ХФЗ 0,0631±0,006 -30±17 12.86 6,3 Экстракт элеутерококка Санитас0,08l9iO,005 12.84 8,2 0, 5 2,64±0,27 59,1±9,3 0,001 Высокая 5 1,95±0,05 56, «йгА:, 25 0,001 Высокая 0,85iO,05 5 2,2+0,1 38,6±8,9 0,001 Высокая 1,35±0,18