Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частнос и к способам определения противостолбнячного иммунитета.

Целью изобретения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного антитоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации.

Поставленная цель достигается благодаря найденной возможности титровать рабочую дозу антигена (очищенный концентрированный столбнячный анатоксин) по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке (ГИСК им. Тарасевйча); модифицировать коммерческий антигенный эритроцитарный столбняч-ный диагностикум путем внесения в жидкую фазу дИагностикума очищенирго столбнячного анатоксина до концентрации, равной предварительно оттитрованной рабочей дозе; проводить реакцию при комнатной температуре.

Предлагаемый способ снижает трудоёмкость постановки реакции, так как ликвидируется отдельный процесс раскапывания рабочей дозы антигена (она вносится в реакцию в составе антигенного зритроцитарного диагностикума); ускоряет не менее чем на 1ч получение результатов РТНГА, так как ликвидируется отдельный этап контакта испытуемых сывороток с рабочей |цозой антигена (в нашей модификации он происходит в присутствии антигенного зритроцитарного диагностикума). что позволяет ставить РТНГА по той же рабочей схеме, что и РНГА. т.е. действительно параллельно; ликвидируется надобность в антительном эритроцитарном диагиостикуме для титрования рабочей дозы антигена, так как оно проводится по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке; ликвидируется необходимость в термостате, так как контакт испытуемой сыворотки с рабочей дозой антигена проводится при комнатной температуре; позволяет не только оценить специфичность РНГА по эффекту ее торможения, но и количественно откорректировать титр определяемых антител в испытуемой сыворотке, так как рабочая доза антигена оттитрована по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке к определенному, заранее выбранному количеству Международных единиц (столбнячного анатоксина).

Способ осуа;ествляется следующим образом.

. Пример, Для осуществления предлагаемого способа проводят титрование рабочей дозы антигена к 0,1 МЕ/мл стандартной противостолбнячной сыворотки (принятая величина защитного титра при столбняке). Для этого в микротитраторе Такачи в о.бъеме 0,05 мл готовят серийные разведения антигена - очищенного концентрированного столбнячного анатоксина (ОСА), начиная с разведения 1:125, на следующем растворителе; физиологический раствор (,27,25) с добавлением до 1% нейтрального формалина. В каждый ряд серийных разведений ОСА добавляют по 0,05 мл стандартной противостолбнячной сыворотки, первоначально содержащей в 1 мл 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 ME столбнячного анатоксина. Указанные разведения готовят из цельной стандартной противостолбнячной сыворотки, содержащей в 1 мл 4 ME столбнячного анатоксина. Состав растворителя указан выше, В. последствии их подвергают всем манипуляциям обычным для испытуемых сывороток (инактивация, истощение, разведение 1;10), т.е. в конечном, готовом для постановок виде в 1 мл указанных выше разведений стандартной сыворотки, учитывая дополнительное разведение 1; 10, будет соответственно содержаться 0,02; 0,01; 0,005; 0,025 ME столбнячного анатоксина. Для каждого разведения сыворотки готовят два ряда серийных разведений ОСА-дубль -результата. После встряхивания пластины оставляют на 1 ч при комнатной температуре, а затем закапывают коммерческий столбнячный эритроцитарный антигенный диагностикум (СД). встряхивают иммунологический планшет и оставляют при комнатной температуре до оседания эритроцитов (1,5-2 ч). После оседания эритроцитов учитывают результаты титрования рабочей дозы антигена. За рабочее разведение антигена принимается то разведение ОСА, которое способно полностью связать столбнячный анатоксин концентрацией менее 0,1 МЕ/мл (в перерасчете на цельную сыворотку, не разведенную 1:10) и не способное полностью нейтрализовать сыворотки, содержащие 0,1 МЕ/мл и более, что в первом случае выражается отсутствием агг0 лютинацииСД, а во втором случае в наличии агглютинации СД. Для использованной серии ОСА рабочее разведение равнялось 1:1000.

Определив рабочую дозу ОСА, добавляем цельный ОСА в коммерческий столбнячный -эритроцитарный антигенный диагностикум в количестве, адекватном рабочей дозе. Пример: берут 99,9 мл 0,5% СД, добавляют0,1 мл цельного ОСА, перемеши0 ваюти после оседания эритроцитов удаляют из надосадка 0,1 мл. Получают 99,9 мл 0,5 % СД, содержащего в жидкой фаза ОСА в разведении 1:1000.

После этого проводят контроль правильности разведения рабочей дозы антигена. В лунки иммунологических планшетов закапывают по 0,05 мл стандартной сыворотки, содержащей 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 МЕ/мл столбнячного анатоксина (истощенных, инактивированных, разведенных 1:10), на каждое разведение по 3 лунки. Затем.во все лунки добавляют по 0,05 мл СД,содержащего ОСА в рабочем разведении. В лунках, содержащих стандартную сыворотку в

5 концентрации 0.,2 и 0,1 МЕ/мл (в перерасчете на цельную, не разведенную 1:10), при правильно подобранном разведении ОСА должна быть агглютинация, а в лунках с сывороткой, содержащей 0,05 и 0,025 МЕ/мл,

0 она должна отсутствовать. После контроля правильности разведения рабочей дозы ОСА такой модифицированный диагностикум (МД) может хранится в бытовом холодильнике и использоваться для постановки

5 РТНГА длительное время (срок наблюдения б мес).

Постановка РТНГА проводится параллельно с РИГА. В микротитраторе Такачи, в объеме 0,05 мл, делают серийные разведения испытуемых сывороток, подготовленных к реакции по обычной для РНГА методике (инактивация, истощение, разведение 1:10). Разведение каждой сыворотки дублируется в других рядах - один для

5 РНГА, второй для РТНГА. В первый ряд (для РНГА) закапывается СД, во второй ряд ля РТНГА) - МД, содержащий кроме сенсибилизированных эритроцитов не фиксированный на эритроцитах ОСА в рабочей дозе. После оседания эритроцитов (через 1,5-2 ч)

производится учет результатов. Реакция сопровождается общепринятыми серологическими контролями (контроль сыворотки, контроль СД и МД).

Учет и трактовку результатов проводят на примере испытуемой сыворотки, содержащей 0,8 ME/мл столбнячного антитоксина.

По сравнению РИГА с испытуемой и со стандартной сыворотками устанавливают, что титр.испытуемой сыворотки равен 0.8 МЕ/мл. При этом конец реакции в РИГА при определенной активности СД определяется в восьмой лунке. В то же время конец реакции в РТНГА определяетея в четвертой лунке, т.е. она соответствует концентрации анатоксина в цельной сыворОтке, равной 0.1 МЕ/мл, так какантитоксин в 5, б, 7 и 8 лунках (где он присутствует согласно РИГА) полностью связался рабочей дозой ОСА. Но в испь(туемой сыворотке столбнячных антител в 8 раз больше (4 лунка - 0,1 МЕ/мл; 3-я 0,2 МЕ/мл; 2-я - 0,4 МЕ/мл; 1-я - 0,8 МЕ/мл}. т.е. 0,8 МЕ/мл. Сокращение ряда агглютинации по сравнению с РИГА с 8 до 4 лунок говорит в евою очередь о специфичности реакции. Таким образом, результат РНГА подтверждается и качественно и количественно.

ЕСЛИ при Данных условиях конец реакции в РТНГА будет как и в РНГАопределяться в 8-й лунке, то торможения не произошло, т.е. реакция не специфична и результат учитывать нельзя.

Возможен вариант, когд1а по РНГА конец реакции в 8-й лунке, а по РТНГА в 1 или 2. Следовательно,по РТНГА титр сыворотки значительно ниже,.чем по РНГА (по РТНГА 0,1-0,2 МЕ/мл, а по РНГА-0,8 МЕ/мл),,т.е. специфические антитела в испытуемой сыворотке присутствуют, но РНГА завысила результат и в окончательном варианте титр анатоксина в испытуемой сыворотке устанавливается по РТНГА- 0,1-0,2 МЕ/мл.

Пригодность данного способа базируется на данных, свидетельствующих, что введение а состав столбнячного эритроцитарного антигенного диагностикума рабочей дозы антигена (ОСА) никак не отражается на активности сенсибилизированных эритроцитов, так как при отмывании от растворенного не связанного антигена они приобретают первоначальные свойства. Многочисленные (более 100) параллельные с общепринятым способом постановки. РТНГА показали, что совмещение этапа контакта свободного антигена с испытуемой сывороткой и этапа контакта с ней эр)итроцитарного диагностикума никак не влияет на качество реакции, ее вид не отличается от общепринятого варианта РТНГА. артефактов не наблюдалось.

Параллельным титрованием 83 сыворбток было изучено влияние температурногй 5 фактора на ход реакции (см. табл. 1).

При этом установлено, что при инкубации сывороток и рабочей дозы антигена в термостате (1 ч при 37°С) торможение идет более полно, т.е. сокращение ряда агглютинации в РТНГА при использовании термостата примерно на 2 разведения (2 лунки) больше, чем при комнатной температуре (20-25С). Однако при зтом сохраняется очень высокая прямая корреляция результатов обоих: вариантов постановки - коэффициент корреляции - 0,91, что позволяет в предлагаемом способе исключить использование, термостата и проводить реакцию при комнатной температуре.

0 При 387 параллельных исследованиях со 100 сыворотками была проверена пЪвторяемость результатов предлагаемого способа постановки РТНГА. При этом ни в одном случае не было определено расхождений,

5 более чем на одно разведение, что для серологии не считывается существенным,.а в 223 случаях (57,6 ± 5,0%) отмечены полные совпадения результатов реакции, что говорит о практически полной воспроизводимости результатов в предлагаемой модификации по-, становки РТНГА.

В двух опытах было проведено титрование рабочей дозы очищенного концентрированного столбнячного анатоксина по

5 стандартной сыворотке, которое для использованной серии ОСА выявило наличие зависимости между разведением антигена и его нейтрализующей способности, что позволило придать результатам РТНГА свой0 ства, позволяющие определять с ее

I помощью титр анатоксина в- испытуемой

сыворотке, т.е. корригировать результат

РНГА не только качественно на предмет

специфичности, но и количественно, что отличает предлагаемый способ от общепринятой методики.

Сводные данлыеобобщих и отличительных существенных признаках предлагаемого способа и прототипа приведены в табл. 2.

0 Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед .общепринятым способом: внесение в реакцию . рабочей дозы антигена в составе эритроцитарного диагностикума позволяет ставить

5 РТНГА одноэтап.но, что не менее чем на 1 ч ускоряет учет результатов и дает возможность учесть реакцию одновременно с РНГА; доза антигена титрования по отношению к стандартной сыворотке позволяет количественно корригировать титры.

анатоксина по РИГА при возможных ошибках; постановка реакции становится менее трудоемкой, ликвидируется необходимость в дополнительном оборудовании (термостат) и реагентах (антительНый диагностикум).

Ф о р м у л а и 3 о б р е т е и и я Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации, включающий предварительное определение рабочей дозы специфического антигена с последующим выявлением соответствующих специфических антител в исследуемой сыворотке после внесения специфического антигена и антигенного эритроцитарного

Степень торможения результатов РИГА в РТНГА при использовании термостата и без него при титрований сывороток людей

т;

2 I 3 лунки ( лунки

Комнатная

2лунки

3лунки лунки

5лунок

6лунок

7лунок

8лунок Всего

диагностикума по торможению агглютинации, отличающийся тем, что, с целью упрощения, сокращения времени и повышения точности титрования столбнячного анатоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемаггяютинации и торможения непрямой гемагглютинации, рабочую дозу антигена - очищенного концентрированного столбнячного анатоксина определяют при титровании со стандартной противостолбнячной сывороткой, вносят антиген в состав зритроцитарного антигенного диагностикума и используют на первом этапе постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации при комнатной температуре.

т а б л и ц а 1

8 I Всего

лунок I

{лунок лунок L-.-.

8

1 8

26

2 2

8 13

33

15

1

83

23 36

21 Характеристика способа-прототипа и пр реа(ции торможения непрям Способ-прототип Материалы и оборудование, нео ,Эритроцитарный антигенный столбнячный диагностикум (коммерческий) Стандартная противостолбнячная сыроротка (коммерческая) Очищенный концентрированный столбнячный Неадсорбированный жидкий анатоксин (коммерческий) Антительный столбнячный эритроцитарный диасностикум (коммерческий не выпускается) Термостат Титрование рабочей дозы антиге Постановка РИГА со столбнячным антительиым эритроцитарным диагностикумом, рабочая доза 2-| антигенных единицы ,. i Схема постановки и условия ре 1-й этап - Контакт рабочей дозы антигена с испытуемой сывороткой (термостат, 1 ч, ), , „ 2-и этап - закапывание эритроцитарного антигенного, диагностикума, контакт с „ - . испытуемой сывороткой и оседание сенсибилизироеанных эритроцитов (комнатная температура, 1,5-2 ч) . Время до учета реакции 2,5-3 м Информация, получаемая в резул Специфичность постановки РИГА Таблиц а 2 лагаемого способа постановки гемагглютинации I Предлагаемый способ постановки димые для реакции Эритроцитарный антигенный столбнячный диагностикум коммерческий) Стандартная противостолбнячная/сыворотка коммерческая Очищенный концентрированный столбнячный неадсорбированный жидкий анатоксин (коммерческий) Не нужен Не нужен,, Постановка РТНГА с серийными разведениями столбнячного, анатоксина по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке в концентрациях 0,1; 0,05; 0,025 НЕ/мл, рабочая доза - разведение анатоксина, способное связать полностью столбнячный анатоксин кон,цеитрацией менее 0,1 МЕ/мл, ии 1-этап - закапывание модифицированного антигенного эритроцитарного диагностикума, содержащего в своем составе рабочую дозу антигена и сенсибилизированные антигеном эритроциты, ,- „ реагирование свободного антигена с испытуемой сывороткой, а затем несвязавшегося анатоксина антигенным столбнячным эритроцитарным диагностикумом (комнатная температура, 1,5-2 ч), 1,5-2 ч ате реакции. Специфичность постановки РИГА Точность определения титра анатоксина в испытуемой сыворотке по РИГА свозможной его коррекцией по РТНГА.;

Изобретение относится к медицине, о частности к способам определения противостолбнячного иммунитета. Целью изобретения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного анатоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагг- лютииации и торможения непрямой гемагглютинации. Для достижения поставленной цели рабочая доза антигена титруется по отношению к стандартной Противостолбнячной сыворотке, антигенный столбнячный зритроцитарный диагно- стикум модифицируется путем внесения в жидкую фазу диагностикума. очищенного, концентрированного столбнячного анатоксина до концентрации, равной предварительно оттитрованной рабочей дозе, реакция проводится при комнатной температуре. 2 табл.