Способ иммуноэлектроосмофореза Советский патент 1992 года по МПК G01N33/561 

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного иммуноэлектрофореза, и может найти применение при изучении количественных изменений специфических антигенов.

Цель изобретения - количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза при использовании поливалентных сывороток.

Способ осуществляется следующим Образом.

Проводят анализ антигена методом встречного иммуноэлектроосмофореза, окрашивают образующиеся преципитаты Кумасси R-250.

Для определения количества антигена иммунофореграмму подвергают стандартной обработке (сушка, окраска, промывка), затем вырезают участок фореграммы с окрашенными преципитатами. Площадь вырезаемого участка

S A -В.

где А - расстояние между центрами лунок, мм;

В - диаметр лунки + 4 мм (2 мм с каждой стороны лунки), мм.

Перед вырезанием сухой гель смачивают дистиллированной водой. Вырезанный участок фореграммы с окрашенным преципитатом элюируют 0,2 М ацетатным буфером. рН 5.0. содержащим 0.1%-ный додецилсульфат (ДДС) Na, при 50°С в течение 1ч.

Экстракт фотометрируют при 565 нм, а вычисление проводят исходя из соотношения оптических плотностей растворов анализируемого образца и наиболее близкого по окраске контрольного образца с известным содержанием антигена. Пример 1. Навеску (1 г) листьев пшеницы, зараженных ржавчинным грибом, растирают в 0.1 М трис-глициновом буфере, рН 8,6. содержащем 0,1% аскаорбата натрия (5 мл). Экстракт центрифугируют при 6 тыс. g и сгущают криодиализом до 1/10 исходного объема. 0,05 мл надосадочной жидкости наносят в верхние лунки фореграммы. Размеры фореграммы определяются размером стекол, на которые нанесен гель. Шесть лунок на фореграмме содержат определяемый антиген в известных концентрациях. В нижние лунки вносят антисыворотку с титром 1:128. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см и силе тока 1,5 мА/см. Участок фореграммы с окрашенными преципитатами вырезают, как описано. Окраску элюируют 3 мл 0,2 М Naацетатного буфера, рН 5,0, содержащего 0,1 % ДДС Na, в течение 1 ч при 50°С. После замеров оптической плотности при 565 нм подбирают образец с известным содержанием антигена, оптическая плотность которого наиболее близка оптической плотности анализируемого образца. Далее из соотношения этих оптических плотностей опреде ляют концентрацию ржавчинных антигенов в анализируемом образце и проводят пересчет на 1 г сырого веса. В каждом образце грибные антигены определялись параллельно и методом ракетного электрофореза по Лоуреллу. В табл. 1 представлены результаты сравнения определения грибных антигенов в листьях пшеницы методом ракетного элекТ а б л и ц а 1 трофореза и количественного электроосмофореза. Как видно из табл.1, при определении грибного белка методом ракетного злектроиммунофореза по Лореллу с использованием поливалентной сыворотки, реагирующей с множественными антигенами гриба, получаются резко (в 3-4 раза) заниженные результаты по сравнению с теми, которые дает предлагаемый способ, предусматривающий фотометрирование красителя, связанного комплексом антиген - антитело. П р и М е р 2. К экстракту здоровых листьев пшеницы добавляют определенный объем гомогенатй из уредоспор стеблевой ржавчины с известным содержанием белка и проводят определение антигена в экстракте методом количественного электрофореза. Результаты определения приведены в табл.2, Как видно из табл.2, предлагаемый способ отличается хорошей чувствительностью и точностью в достаточно широком диапазоне концентрации, Формулаизобретения Способ иммунрэлектроосмофореза, включающий иммунопреципитацию с помощью встречного иммуноэлектрофореза, окраску образующихся преципитатов, отличающийся тем, что, с целью количественного определения антигена, после завершения иммуноэлектроосмофореза вырезают участки геля с окрашенным преципитатом. элюируют их 0,1%-ным раствором додецилсульфата натрия в 0,1 М ацетатном буфере рН 5,0 с последующим фотометрированием элюата.

Таблица2

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного имму-ноэлектрофореза, и может быть использовано для изучения количественных изменений антигенов. Цель изобретения - количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза. Для осуществления способа проводят 'анализ антигена методом встречного иммуноэлект- рофореза и после окрашивания пластины вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0.1%-ным раствором додецилсульфата натрия в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0. с последующим фотометрированием элюата. 2 табл.