Способ приготовления системы для дифференциации энтеробактерий Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа приготовления дифференциально-диагностических сред.

Известен способ приготовления лиофи- лизированной среды состава, %: углевод.1; пептон 0,5; феноловый красный 0,0018; растворитель 100 мл.

Ингредиенты перемешивают при комнатной температуре, затем автоклавируют при 118°С в течение 15 мин, после чего помещённые в водяную баню при 50°С микропробирки размером 10x75 мм заполняют средой. Количество среды, помещенное в каждую пробирку, составляет 0,1 мл. После заполнения пробирки помещают в камеру лиофильной сушки при -40°С и выдерживают 1 ч. В камере устанавливают вакуум. Затем камеру подогревают до 21°С в течение 24 ч, после чего вакуум разрушают и пробир1 ки вынимают. Полученную таким образом среду хранят с осушителем и расходуют по мере надобности.

Недостатками данного способа являются сложность, длительность (25 ч) и много- этапность, а также необходимость использования осушителя при хранении.

Известен также способ получения пита-1, тельной среды для идентификации энтеробактерий состава, г/л: основной субстрат - лимоннокислый натрий 5,0-6.0; вспомогательные субстраты - глюкоза 0,6-0,7; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,8- 1,0; пептон 1,0-1,2; цистеин 0,02-0,04; фосфорнокислый аммоний 0,5-0,7; хлористый натрий 5,0-7,0; индикаторы - бромтимоло- вый синий 0,08-0,1; крезоловый красный 0,08-0,1; .дистиллированная вода остальное.

Среду разводят в десятикратно меньшем объеме воды и .микродозируют по 0,02 мл в ячейки полимерного планшета, высушивают, стерилизуют ультрафиолетом. (УФ) и герметизируют. Для стабилизации среды добавляют поливиниловый спирт (ПВС) на этапе растворения в количестве

Ё

VI

О СА СЛ

0,8-1 г/л. В таком виде среда долго хранится.

Технологические возможности способа могут быть расширены, увеличена номенклатура сред, приготавливаемых в пластинах биохимических, дифференцирующих энте- робактерии.

Известен способ приготовления системы для дифференциации энтеробэктерий RapidD 20E фирмы Api, который основан на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении Сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат м индикатор с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией.

В качестве аминокислот в данной системе используют лизин и орнитин, а в качестве индикатора - бромкрезоловый пурпурный, высушивание ведут путем лио- филизации, стерилизацию проводят при помощи автоклава (по традиционно сложившейся практике создания систем данного вида).

Известный способ не всегда обеспечивает т жость дифференциации, сложен из- за необходимости использования дополнительного оборудования (автоклава, установки для лиофилизированной сушки).

Целью изобретения является повышение точности дифференциации и упрощение приготовления и использования системы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления системы для дифференциации энтеробзктерий, основанному на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении Сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией, в состав среды в качестве аминокис- лоты вводят аргинин, а в качестве индикатора- спиртовой раствор бромтимо- лового синего, а высушивание пластин ведут при 38-40°С с одновременной стерилизацией ультрафиолетом, а также тем, что в лунки пластины после высушивания среды вносят поливиниловый спирт.

Включение теста с аминокислотой - аргинином обусловлено его большой диагностической значимостью. Данный тест является ключевым при дифференциации микроорганизмов рода Enterobacter. Тест, на аргининдигидролазу - один из основ- ных дифференцирующих Cltrobacter amalonatfcus от других видов этого рода и

является также разделяющим род Klebslella от рода Enterobacter наряду с тестом на подвижность. Таким образом, введение в состав системы теста на аргинин повышает

ее точность, упрощает идентификацию, избавляет от необходимости использования дополнительных тестов.

Предварительное растворение индикатора бромтимолового синего в этиловом

0 спирте способствует более тщательному его растворению, чем, если бы его растворяли вместе с остальными компонентами среды с применением воды. Использование в качестве растворителя для смеси компонен5 тов этилового спирта приводит к перенасыщению среды алкоголем, и полученная среда обладает большим ингибиру- ющим эффектом по отношению к выращиваемым на среде микроорганизмам.

0 Режим высушивания при 38-40°С является наиболее оптимальным, так как эта температура неблагоприятна для развития микроорганизмов и не приводит к деформации полимерного планшета, в котором нэхо5 дится среда.

Одновременное облучение УФ ведет к сокращению времени получения среды и обеспечивает условия стерильности на всем протяжении этапа высушивания. Кислая

0 среда, необходимая для активизации декар- боксилазы аминокислот (рН 5,0), делает невозможным внесение в раствор ПВС, так какданный рН среды способствует его свертыванию. Поэтому для обеспечения ста5 бильности во время хранения ПВС вносят после этапа высушивания,

П р и м е р 1. Различные концентрации компонентов среды приведены в табл. 1. В качестве аминокислоты используют

0 аргинин. Сухие компоненты среды смешивают, добавляют витамин и предварительно приготовленный индикатор-бромтимоловый синий, затем полученную смесь доводят до 100 мл стерильной дистиллированной во5 дои, устанавливают рН 5.0, дозируют по 0,02 мл в ячейки дифференцирующей пластины и сушат при 40°С с одновременной стерилизацией УФ-лучами.

Испытание среды проводят с помощью

0 контрольных штаммов микроорганизмов. Результаты испытаний на примере среды с аминокислотой - аргинином представлены в табл. 2,

Результаты испытаний показали, что в

5 опыте с 5-й композицией среды (с самым минимальным содержанием составляющих компонентов) наблюдаются нестабильные результаты, запаздывание ферментации, и эти реакции расцениваются как отрицательные.

Так, например, у Citrobacter ama- lonaticus и Enterobacter cloacae (табл. 2) отмечены отрицательные результаты при положительном контроле (в качестве контроля используют классическую среду Бирге- ра - Крушинской). Композиции 1-4 испытывают в тех же условиях, что и композицию 5, Данные среды работают хорошо, положительные результаты фиксирутся в срок, окраска индикатора при положитель- ной реакции контрастная по отношению к окраске отрицательной реакции. Композиция 1 исключена из экономических сообра- жений, так как нецелесообразно дополнительно расходовать реагенты при хороших результатах на средах с меньшим их содержанием.

Таким образом,композиции 2-4 выбраны как оптимальные.

П р и м е р 2. Осуществляют как пример 1. Готовят композицию 3 (табл. 1), меняют диапазон температуры сушки от 38 до40°С. Оптимальная температура сушки, выбранная в пределах 38-40°С, неблагоприятная для развития микробов, кроме того, темпе- ратура ниже 38°С значительно затягивает сроки сушки, что отражается на качестве препарата. Температура выше 40°С разрушает некоторые компоненты среды и ведет к дефо рмации полихлорвинилового план- шета, в который разлиты среды.

П ри мерЗ. Осуществляют как примеры 1 и 2. Готовят композицию 3 за исключением вводимого количества индикатора. К композиции 3 (без индикатора) прибавляют индикатор в различных объемных процентах (от 9 до 13%). Полученные варианты сред высевают на бактериальную контаминацию.

Вариант с 9%-ным содержанием этило- вого спирта признан непригодным, так как при высеве на стерильность наблюдается

рост микроорганизмов выше, допустимой нормы (20 колоний на 1 чашку). Варианты с 10-13%-ным содержанием этилового спирта пригодны; наблюдается допустимый рост микробов. Таким образом, варианты среды с 10-12%-ным содержанием этилового спирта признаны оптимальными. Варианте 13%-ным содержанием этилового спирта не учитывается из-за удовлетворительных результатов на вариантах среды с более низким его содержанием.

Предлагаемый способ позволяет приготовить дифференциально-диагностические среды разного состава, которые в совокупности могут образовывать идентификационную систему одноразового использования, пригодную для полевых условий. Сокращается время приготовления среды за счет совмещения стерилизации с высушиванием.

Формула изобретения 1. Способ приготовления системы для дифференциации энтеробактерий, основанный на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении Сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор,с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения точности дифференциации, упрощения приготовления и использования, в состав среды в качестве аминокислоты вводят аргинин, а в качестве индикатора - спиртовой раствор бромтимолового синего, а высушивание пластин ведут при 38-40°С с одновременной стерилизацией ультрафиолетом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем. что в лунки пластины после высушивания среды вносят поливиниловый спирт.

Использование: медицина, микробиология, биотехнология, Наборы для дифференциации энтеробактерий готовят путем приготовления питательных сред, содержащих раствор бромтимолового синего. Дифференциальную среду .вносят в лунки пластины, высушивают при 38-40°С и одновременно стерилизируют УФ. После подсушивания в лунки дополнительно вносят поливиниловый спирт. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

45

Таблица 1

Таблица 2