Питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии а именно к питательным средам для идентификации энтеробакте рий.

Известна питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра, включающая в качестве источника азота пептон в качестве субстрата - глюкозу и буферную соль - калий фосфорнокислый однозамещенный при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Пептон5

Глюкоза5

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО/05

Устанавливают рН 6,9-7,0.

Указанная среда недостаточно точно дает возможность дифференцировать энтеробактерий. Это обусловлено тем. что реакция Фогес-Проскауэра основана на выявлении различий в конечных продуктах

метаболизма глюкозы микроорганизмами смешанно-кислотной и бутиленгликольной ферментации, промежуточным продуктом которой является гщетоин Для выявления этого продукта к среде необходимо добавить реактивы щелочь, которая окисляет ацетоин до диацетила, и а-нафтол, который в присутствии диацетила дает комплекс красного цвета различной интенсивности Учет реакции после добавления реактивов и перемешивания ведут через 15-20 мин в течение 30 мин За это время интенсивность окраски меняется от слабо-розового до малинового и очень тр /дно по цвету отдифференцировать слабоположительные реакции (розовый цвет) or отрицательных (бледно- розовый)

Кроме того, при постановке реакции Фогес-Проскауэра и:пользуют реактивы концентрированную щелочь (40 КОН) ио(- нафтол которые аызчвают ожоги раздраtawucrA

жают кожу, слизистые оболочки глаз, дыхательных путей.

Целью изобретения является повышение чувствительности среды для реакции Фогес-Проскауэра и упрощение проведение реакции.

Указанная цель достигается тем, что в среду дополнительно вводят поливиниловый спирт, в качестве индикатора рН - бромкрезоловый пурпурный, а в качестве источника азота - аминопептид при следующем соотношении компонентов, г/л:

Аминопептид9,0-11,0

Глюкоза11,0-13,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный

(КН2Р04)9,0-11,0

Бромкрезоловый пурпурный0.192-0.196

Поливиниловый спирт4,0-6,0

Дистиллированная вода Остальное

Изобретение исключает возможность неправильной оценки за счет повышения чувствительности среды путем введения в качестве индикатора рН бромкрезолового пурпурного, а в качестве источника азота - аминопептид.

При этом положительная реакция приобретает фиолетовый цвет, а отрицательная - желтый.

Кроме того, среда дает возможность учета реакции одномоментно по всем 12 параметрам анализа в то время, как прототип требует дополнительного внесения двух реактивов и времени 30 мин для образования цветности реакции.

Среду готовят следующим образом.

Взвешивают все компоненты среды, затем приготавливают рабочий раствор. Для этого все ингредиенты при перемешивании доводят до кипения. После этого устанавливают рН раствора 6,95-7,05 с помощью 10%- ного раствора едкого натра под контролем иономера универсального ЭВ-74. Среду разливают в пробирки по 5 мл и автоклави- руют при 110°С в течение 30 мин.

Среду используют следующим образом.

В прозрачные 96-луночные полистироловые планшеты наряду с другими субстрат- но-индикаторными средами в один из вертикальных рядов вносят по 0,05 мл полученной среды с помощью дозатора пипеточ- ного. Затем планшет со средами для подсушивания помещаютвтермостатирующее устройство при 39-40°С на 3-4 ч. Одновременно производят облучение ультрафиолетовыми лампами с целью стерилизации. После сушки планшеты герметизируют в полиэтиленовые пакеты и они готовы к применению. Полученные планшеты в дальнейшем именуют системами мультимикротестов (ММТ-Е-2).

Пример 1. Готовят среду следующего- состава, г/л:

Аминопептид9,0

Глюкоза11,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2Р04)9,0

0Бромкрезоловый пурпурный 0,192

Поливиниловый спирт4,0

Дистиллированная вода Остальное Испытание работы среды в реакции Фогес-Проскауэра проводят с помощью следу- 5 ющих штаммов: Klebsiella pneumonia K-9 и Enterobacter cloacae A-186. Для исключения ложноположительных результатов в контроле используют штаммы Escherichia coli 846 и Proteus vulgaris Hx 19. Цвет среды в лун- 0 ках с положительно реагирующими штаммами остается фиолетовым, а отрицательно реагирующие штаммы изменяют цвет среды на желтый.

Пример 2. Состав среды, г/л: 5Аминопептид10,0

Глюкоза12.0

КН2Р0410,0

Бромкрезоловый пурпурный0 192

Поливиниловый спирт4,0

0Дистиллированная вода Остальное

Результаты испытания с примером 1 одинаковы.

Пример 3 Состав среды, г/л: Аминопептид11,0

5Глюкоза13,0

КН2Р0411,0

Бромкрезоловый пурпурный 0,194 Поливиниловый спирт5,0

Дистиллированная вода Остальное 0Результаты испытаний одинаковы с

примерами 1 и 2.

Пример 4. Состав среды, г/л: Аминопептид8,0

Глюкоза10,0

5КН2Р048,0

Бромкрезоловый пурпурный0.190

Поливиниловый спирт6,0

Дистиллированная вода Остальное Результаты испытаний показывают 0 (табл.1), что при посеве 100 млн.мик.клеток/мл штамм Proteus vulgaris 19 дал лож- ноположительный результат. Увеличение посевной дозы до 500 млн.мик.клеток/мл позволило избежать ложных реакций. 5П р и м е р 5. Состав, среды, г/л:

Аминопептид12,0

Глюкоза14,0

КН2Р0412,0

БромкрезолоЕ1Ый пурпурный0.196

Поливиниловый спирт7 О

Дистиллированная вода Остальное

Результаты испытаний неодинаковы с примерами 1-3. Штамм Enterobactercloacae А-186 при посеве 100 млн.мик.клеток/мл дал ложноотрицательный результат (табл.1).

Пример 6. Способ использования системы микротестов.

Для постановки реакции Фогес-Проска- уэра предварительно готовят суспензии ис- пытуемых микроорганизмов в дистиллированной воде (1-2 колонии на 2 мл воды) и в лунки каждого горизонтального ряда полистиролового планшета вносят одну из приготовленных суспензий по 0,1 мл в каждую лунку. Затем осуществляют инкубацию посевов при 37 1°С. Учет результатов производят через 18-24 ч. При этом полученный фиолетовый цвет среды в лунке расценивают как положительный, желтый - как отрицательный,

Данные по чувствительности среды и точности дифференцирования в реакции Фогес-Проскауэра приведены в табл.1.

Из табл.1 видно, что чувствительность предлагаемой среды в 4 раза выше, чем у прототипа (примеры 1-3).

Уменьшение количества глюкозы и ами- нопептида (пример 4) в составе среды нецелесообразно, так как ведет к искажению результатов (ложноположительные реакции.

Увеличение количества глюкозы и ами- нопептида (пример 5) ведет к ложноотрица- тельным результатам.

Таким образом, оптимальный вариант , рабочей среды находится в пределах, г/л:

Аминопептид9,0-11,0

Глюкоза11,0-13,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный9,0-11.0

Бромкрезоловый

пурпурный0,192-0,196

Поливиниловый спирт4,0-6,0

Дистиллированная вода Остальное

В подтверждение точности дифференциации предлагаемой среды были исследованы 50 выделенных штаммов энтеробакте- рий.

Результаты исследований сведены в табл.2.

Данные табл.2 свидетельствуют, что

точность дифференциации энтеробактерий по реакции Фогес-Проскауэра на предлагаемой среде составляет 96%, тогда как на среде по прототипу 76%.

Предлагаемая среда по сравнению с известной обеспечивает следующие преимущества: повышает чувствительность реакции Фогес-Проскауэра в 4 раза, а точность дифференциации энтеробактерий на 22%, упрощает проведение реакции (исключает добавление реактивов для выявления реакции), облегчает учет результатов вследствие большой контрастности цветов (фиолетовый -желтый).

Кроме того, среда удобна в употреблении, что дает возможность использовать во всех бактериологических лабораториях здравоохранения,ветеринарии и других отраслях народного хозяйства.

Формула изобретения

Питательная среда для реакции Фогес- Проскауэра, содержащая источник азота, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный, индикатор и дистиллированную

воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения чувствительности среды и упрощения проведения реакции, она дополнительно содержит поливиниловый спирт, в качестве индикатора - бромкрезоловый

пурпурный, а в качестве источника азота - аминопептид при следующем соотношении компонентов, г/л:

Аминопептид .9,0-11.0

Глюкоза11,0-13,0 Калий фосфорно-кислый однозамещенный9,0-110 Бромкрезоловый пурпурный0,192-0,196 Поливиниловый спирт4,0-6,0 Дистиллированная водаОстальное

К.Pneumonia К 9

Е.cloacae F 186

P.vulgaris Hx19

Е.coli 846

К.pneumonia

Е.cloacae F 186

P.vulgaris Hx19

Е.coli 846

К.pneumonia К 9

Е.clacae F 186

P.vulgaris Hx19

E.coli 846

К.pneumonia К 9

Е.cloacae A 186

P.vulgaris Hx19

Е.coli 846

К.pneumonia К 9

Е.clocae A186

P.vulgaris Hx19

Е.coli 846

+

+

+

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

+

+

-г

+

+

+ +

+ +

+

+

+

-J-С О

+ +

+ +

+ + + +

+

+

+ +

+ +

оо

+ +

+ +

Klobsiella pneumonia

Использование: медицинская микробиология, питательные среды для идентификации энтеробактерий. Сущность изобретения: питательная среда используется с целью повышения чувствительности среды, точности реакции Фогес-Проскауэ- ра, упрощения способа постановки и учета реакции путем замены питательной основы и введения в состав среды индикатора рН Питательная среда для реакции Фогес-Про- скауэра содержит следующие компоненты, г/л: аминопептид 9,0-11,0; глюкоза 11,0- 13,0; калий фосфорно-кислый однозаме- щенный 9,0-11 0 бромкрезоловый пурпурный 0,192-0,196; поливиниловый спирт 4,0-6,0; дистиллированная вода остальное Новым является введение в состав среды в качестве питательной основы ами- нопептида, а в качестве индикатора рН - бромкрезоловогс пурпурного. 2 табл.

Hofnia aivei

M

Enterobacter cloacae

Enterobacter aerogenes -n-

Proteus vulgaris

Proteus mirabilis

SaLmonella ti

Salmonella

Citrobacter n-

Cttrobacter n

ID.coli

P - различные реакции у розных штаммов вида Euierobacteriaclac.

Составитель Л.Чичкина Техред М. Мор ген та л

Корректор О. Ципле

Редактор Т.Лазоренко

Заказ 2050ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

P

n

+

+

+ + + + + + +

Корректор О. Ципле