Способ определения амфотерицина В в крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования, и может быть использовано для количественного определения амфотерицина В в крови.

Известен ряд способов количественного определения амфотерицина В: микробиологический, хроматографический и спектрофотометрический.

Однако, микробиологический способ обладает низкой чувствительностью (не выше 5 мкг/мл), требует для своего проведения большого количества высокочистых реактивов, специального микробиологического оборудования, высокой квалификации исполнителя и длятся до 2 сут, т.е. метод практически неприменим для серийных экспрессных биохимических исследований в условиях клиники, где требуется проводить контроль содержания препарата в крови в кратчайшие сроки с целью своевременной корректировки вводимых доз.

Для определения амфотерицина В используется высокоэффективная жидкостная хроматография на приборе с патроном Rad-Pak С-18 100 х 8 мм с УФ-детектором с

фильтрами 405 и 340 нм. Отношение поглощения при 405 и 340 нм используется для оценки содержания примесей.

Для определения пробу крови 500 мкл выдерживают 30 мин до ее свертывания, затем пробу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин с целью отделения сыворотки. 100 мкл сыворотки смешивают с 300 мкл подвижной фазы (смесь метанола с 5 мМ раствором ЭД1А с рН 7,8 в соотношении 80:20) и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Отбирается 100 мкл супернатанта, которые и подвергаются анализу в ВЭЖХ-хроматографе.

Чувствительность метода 0,05 мкг/мл, калибровочный график линии до 1,4 мкг/мл, степень открытия амфотерицина В в сыворотке 80%. При концентрации препарата 1.55 мкг/мл коэффициент вариации определения составляет 3% (при п 10).

Недостатком метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в данном случае является то, что для его осуществления необходим ВЭЖ-хроматограф - прибор ограниченной доступности, т.е. осуществить определение амфотерицина В методом

сл

с

VI о со

сл

ВЭЖХ в клинических условиях практически невозможно. Кроме этого, этот метод требует использования особо чистых реактивов и материалов, для работы на хроматографе необходимо иметь подготовленного специалиста.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его экономичности.

Поставленная цель Достигается путем определения флуоресценции амфотерици- на В в среде трихлорукеусной кислоты (ТХУ).

Способ осуществляется следующим образом.

К пробе, содержащей амфотерицин В, прибавляют раствор ТХУ, центрифугируют и после инкубирования определяют флуоресценцию данного раствора.

Пример. Реактивы: раствор ТХУ в дистиллированной воде 10%. Ход определения.

К 1 ч. плазмы крови (0,5 мл) добавляют 10 ч. (5 мл) раствора ТХУ. Пробу интенсивно встряхивают в пробирке в течение 15с. затем содержимое центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость переливают в сухую пробирку и оставляют на 2 ч при 10°С в темном месте. Определяют флуоресценцию данного раствора при длине волны возбуждающего света 383 нм и регистрации при длине света 470 нм. В качестве контрольного раствора использована смесь 5 мл 10%-ного раствора ТХУ и 0,5 мл плазмы крови в отсутствие препарата, обработанная так же, как испытуемый раствор. Концентрация амфотерицина В определяется по градуировочному графику.

С целью обоснования способа проведены следующие исследования.

Определено значение максимума поглощения света раствором амфотерицина В, Определение произведено на спектрофотометре. Полученное значение равно 383 нм.

Определена длина волны испускаемого света. Определение произведено на флуо- риметре, в качестве регистрирующего прибора использован цифровой вольтметр, зашунтированный резистором 300 кОм. Полученное значение равно 470 нм.

Определена зависимость интенсивности флуоресценции от времени инкубирования. Для этого смешивали 0,5 мл раствора препарата концентрацией 3 мкг/мл с 5 мл 10%-ной ТХУ и выдерживали в темном месте в течение 6ч. Периодически производили измерение интенсивности флуоресценции раствора. Полученные результаты приведены в табл.1.

Из табл. 1 следует, что для достижения наибольшей чувствительности метода и постоянства результатов необходимо выдержать смесь в течение 2-3 ч.

Была определена зависимость флуоресценции от условий инкубирования (освещенность, температура).

Раствор амфотерицина В с концентрацией 3 мкг/мл приливают к 10%-ному рас0 твору ТХУ, причем было взято четыре серии пробирок по восемь штук в каждой серии. Условия инкубирования: все серии инкубировали в течение 2 ч. Серия 1 - полная темнота, температура 5°С, серия 2 - полная

5 темнота, температура 20°С, серия 3 - полная темнота, температура 50°С и серия 4 - при солнечном освещении, температура 20°С.

После инкубирования производят за0 мер флуоресценции. Усредненные значения показаний измерительного прибора по каждой серии приведены в табл. 2.

Очевидно, что оптимальным условием для повышения чувствительности метода

5 является инкубация смеси в темноте при пониженной температуре. Воздействие света на инкубируемую смесь должно быть сведено к минимуму.

Определена зависимость флуоресцен0 ции раствора от концентрации ТХУ. в которой производится инкубирование. Для этого четыре серии образцов смешивались с растворами ТХУ с концентрацией 5, 10,20 и 50%. Каждая серия включала восемь проб

5 с концентрацией 3 мкг/мл. После инкубирования в темноте при 10°С была измерена флуоресценция растворов. Результаты измерений представлены в табл. 3.

По результатам измерений можно сде0 лать вывод, что увеличение концентрации ТХУ свыше 10% приводит к снижению флу- оресЦенции раствора. Поскольку снижение концентрации ТХУ ниже 5% ухудшает осаждение белков из биологических жидкостей,

5 то оптимальной концентрацией ТХУ при определении амфотерицина В в биологических жидкостях можно считать 5-10%.

Воспроизводимость предлагаемого способа определения амфотерицина В

0 изучена при параллельном определении десяти проб, содержащих по 1,5 мкг препарата. Результаты определения приведены в табл. 4.

Приведена пригодность метода для оп5 ределения амфотерицина В в биологической жидкости - плазме крови. Для этого в двух параллельных сериях опытов определялось содержание препарата - в одном случае препарат добавлялся в дистиллированную воду, в другом - к плазме крови.

Концентрация препарата в обоих случаях была равна и составляла 2 мкг/мл. Обработка каждой серии проводилась одинаково, в соответствии с примером выполнения определения. Результаты, полученные в каждой серии, совпадали, Таким образом, показана возможность определения амфотерицина В в плазме крови, так как последняя не содержит мешающих определению веществ.

Было показано, что градуировочный график при определении амфотерицина В линеен в пределах 0,03-12 мкг/мл (исходная концентрация), что соответствует содержанию в пробе от 0,015 до 6 мкг.

В табл. 5 дается сравнительная характеристика методов количественного определения амфотерицина В.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить затрай

10

15

20

ты времени на проведение анализа, значительно удешевить и упростить его, сделать более доступной возможность проведения анализа в клинической практике.

Формула изобретения Способ определения амфотерицина В в крови, включающий взятие пробы с последующим ее биохимическим анализом, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения экономичности, пробу смешивают с 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в соотношении 1:10, центрифугируют, инкубируют 2 ч в темноте при 5°С, флуориметрируют при длине еолны возбуждающего света 383 нм и длине еолны регистрации 470 нм, а концентрацию амфотерицина В рассчитывают по калибровочной кривой.

Таблица 1

Таблица 2

Примечание. Х- среднее арифметическое; D - выборочная квадратичная ошибка; а - коэффициент вариации; В - доверительный интервал

Таблицаб

Таблица 4