Способ визуального иммуноферментного анализа биологически активных веществ Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к иммунологии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных меток.

Целью изобретения является определение количественного содержания биологически активного вещества.

Указанная цель достигается тем, что в способе визуального иммуноферментного анализа биологически активных веществ, включающем активацию пористого носителя с последующей последовательной его обработкой исследуемым раствором биологически активного соединения, раствором меченных пероксидазой специфических антител и выявление окрашенного продукта ферментативной реакции, активацию проводят путем обработки бензольным раствором диэтилацеталя п-азидобензальдегида (ДАБА) с последующим градуированным монотонно увеличивающимся по длине носителя УФ-облучением до максимальной освещенности 6-10 Дж-см , обработкой минеральной кислотой и раствором специфических антител, а количественное выявление биологически активного соединения проводят измерением длины неокрашенного участка носителя.

Способ состоит в том, что пористый материал, например бумагу для хроматографии, нейлон или мембраны в форме полоски, пропитывают бензольным раствором диацеталя п-азидобензальдегида. Затем подготовленный материал облучают УФ-светом так, чтобы освещенность полоски увеличивалась по ее длине, и обрабатывают разбавленным водным раствором минеральной кислоты, Активированную полоску погружают сначала в водный раствор специфических антител, затем в раствор анализируемого биологически активного соединения, в раствор специфических антител, меченных пероксидазой, в раствор субстратов и измеряют длину неокрашенного участка полоски,

Обработку носителя ведут раствором диэтилацеталя п-азидобензальдегида с концентрацией 20-90 мг/мл. При концентрации меньшей 20 мг/мл интенсивность результирующего окрашивания недостаточна для количественной визуальной детекции, Концентрация выше 90 мг/мл нецелесообразна, так как не приводит к повышению интенсивности окраски.

Освещение по длине полоски ведут градуированным монотонно увеличивающимся по длине носителя количеством освещенности до величины Дж-см 2. Для этого может быть использована лампа ДРШ-250 с

расстоянием от источника света до облучаемой поверхности 50 см. Последовательно увеличивая время облучения соседних одинаковых по длине участков, получаем полоску с

зонами одинаковой длины, различающимися по интенсивности облучения. Под действием света происходит фотохимическая реакция, в результате которой осуществляется ковалентное связывание молекул диэтила0 цеталя п-азидобензальдегида с поверхностью носителя.

Последующая кислотная обработка приводит к гидролизу ацетальных групп с образованием активных альдегидных групп.

5 Для этой цели может быть использована любая минеральная кислота, например соляная, которая выполняет роль кислотного катализатора при снятии ацетальной защиты. Степень активации носителя, т.е. коли0 чество альдегидных групп на единицу площади, определяется освещенностью соответствующего участка поверхности.

При последующей обработке активированной таким образом поверхности раство5 ром специфических антител происходит их ковалентное связывание с альдегидными группами носителя. Поверхностная плотность антител пропорциональна количеству альдегидных групп на поверхности и зави0 сит от расстояния от данного участка до конца полосы или номера зоны. Инкубацию ведут 1-2 ч при комнатной температуре.

При погружении полоски в анализируемый раствор на поверхности полоски п роис5 ходит образование иммунохимических комплексов Ar-Ат, поверхностная концентрация которых различна в разных зонах и определяется концентрацией анализируемого вещества и поверхностной концентра0 цией иммобилизованных антител.

Инкубация с меченными пероксидазой антителами позволяет количественно выявить образовавшиеся иммунокомплексы. Для их визуализации полоски обрабатыва5 ют раствором, диаминобезидина (ДАБ ) и N262 в присутствии Со2+, в результате чего образуется темно-синий нерастворимый продукт, осаждающийся на носителе в местах локализации ферментной метки.

0 Количество неокрашенных зон уменьшается с возрастанием концентрации определяемого соединения и поэтому число неокрашенных зон (или длина неокрашенного участка полоски) служит показателем

5 концентрации определяемого соединения в растворе.

Таким образом, основными отличительными существенными признаками изобретения является использование для активации поверхности носителя диэтилацеталя n-азидобензальдегида и обработка активированной поверхности специфическими антителами. Использование ДАБА позволяет легко осуществить фотохимическое зарождение на поверхности активных функциональных групп для последующей ковалентной иммобилизации специфических антител. Различная освещенность различных участков поверхности полоски легко достигается варьироварием времени облучения, расстояния до источника света, мощности лампы и изменением других параметров. Так как количество зарождающихся активных групп определяется только одним параметром - освещенностью, то его можно легко регулировать, реально создавая участки с заранее заданным распределением по концентрации альдегидных групп на поверхности матрицы. Распределение активных групп по длине полоски можно устанавливать в зависимости от природы анализируемого объекта и необходимого диапазона измеряемых концентраций, нижней границы определения содержания вещества. В частности, если необходимо получить ответ по принципу да - нет (например, в случае анализов на присутствие вирусов, антител, наркотиков, наличие беременности и т.д.), можно в каждом конкретном случае задать такой закон распределения освещенности, согласно которому при окраши- вании полоски более некоторой критической длины ответ положительный и наоборот.

Возможность легкого варьирования освещенности позволяет добиться регистрируемой визуально четкой границы между окрашенной и неокрашенной зонами.

Дополнительная стадия обработки активированного носителя специфическими антителами позволяет сконцентрировать определяемый антиген, получить более резкую границу окрашенной и неокрашенной зон, а также увеличить интенсивность окраски и значительно уменьшить фон, обусловленный неспецифическим связыванием меченных пероксидазой антител.

Совокупность перечисленных отличительных признаков ранее для решения задачи визуального ИФА не использовалась, и поэтому эти признаки отвечают критерию существенные отличия.

Пример. 1. Бумагу для хроматографии пропитывают раствором п-азидобензальде- гидацеталя в бензоле (45 мг/мл). После высушивания бумагу разрезают на полоски и облучают УФ-светом интенсивности 0,510

-6

Дж-см 2. с

в течение 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 1200 с, что соответствует освещенности каждой полоски 2 3 4 10 5;

5 6 10 5; , 2 , 6. Дж. . Полоски промывают спиртом, высушивают и инкубируют в 0,01 М HCI 30 мин. Затем их помещают в раствор кроличьих антител про5 тив фермента пероксидазы (ПХ) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,14 М NaCI pH 7,2 (ФБ1), на 1 ч при комнатной температуре или на 12 ч при 4°С. После окончания иммобилизации полоски промы10 ваютвО,1 МТрис-HCI. содержащем Т MNaC|, 0,5% Тритона Х-100,0,2% дезоксихолата натрия, рН 9,2 (ТБ1) в течение 1,5 ч (все описанные далее процессы ведут при комнатной температуре) при аккуратном пе15 ремешивании. Затем полоски помещают в раствор блокирующего агента (5% БСА в ФБ1) на 1 ч для снятия неспецифического связывания.

Каждую полоску носителя обрабатыва20 ют отдельно растворами, содержащими ПХ в количестве 160, 32, 16, 3,2. 1,6 нг/мл, контроль в ФБ2 (ФБ1, содержащий 0,05% Тв.и- на-20) в течение 45 мин.

После отмывания несвязавшегося фер25 мента матрицы помещают в раствор субстратов (0,5 мг/мл ДАБ, 0,02% С02+, 0,004% Н202 в БФ1). Реакцию останавливают промыванием холодной водой через 5 мин. Измеряют длину неокрашенного участка

30 полоски.

В табл. 1 приведена градуировочная зависимость длины неокрашенного участка полоски от концентрации антигена (ПХ) в растворе.

35 Пример2. Полоску носителя с иммо- билизированными, как в примере 1, антителами к ПХ, помещают в раствор, содержащий неизвестное количество ПХ на 45 мин при комнатной температуре. После отмывания

40 несвязавшегося фермента матрицу обрабатывают раствором субстратов. Реакцию останавливают промыванием холодной водой через 5 мин. Концентрацию ПХ в анализируемом образце определяют после измерения

45 неокрашенного участка полоски и по граду- ировочной зависимости, приведенной в табл.1.

Пример 2. Полоску носителя с иммобилизованными, как в примере 1, антитела50 ми к ПХ помещают в раствор, содержащий 20 нг/мл, 2 нг/мл ПХ в ФБ2, на 45 мин при комнатной температуре. После отмывания несвязавшегося фермента матрицу обрабатывают раствором субстратов. Реакцию ос55 танавливают промыванием холодной водой через 5 мин. Концентрацию ПХ в анализируемом образце определяют после измерения неокрашенного участка полоски и по граду- ировочной зависимости, приведенной в табл. 1.

В табл. 2 приведены данные статистической обработки полученных результатов анализа.

ПримерЗ. Бумагу для хроматографии пропитывают раствором п-азидобензальде- гидацеталя в бензоле (45 мг/мл). После высушивания бумагу разрезают на полоски и облучают У Ф-светом интенсивности 0, Дж-см 2«с 1 в течение (для разных полосок): 1)40, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 1200,1600, 2000, 2400 с, что соответствует освещенности каждой зоны 3. , 6. 8-10Л 103, 1, Дж. 2) 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 12000, 1600, 2000 с; 3) 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400,1200, 1600с; 4)40, 60, 80, 100,120, 200, 400, 1200 с; 5) 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400 с; 6) 40, 60, 100, 120, 200 с. Полоски промывают спиртом, высушивают и инкубируют в 0,1 М HCI 30 мин. Далее по примеру 1, используя пероксидазу в концентрации 1,6 и 32 нг/мл.

В табл. 3 приведена зависимость длины неокрашенного участка полоски от концентраций ПХ для разных полосок. Из табл. 3 следует,.что увеличение освещенности выше Дж-см 2 нецелесообразно.

Пример 4. Полоски капроновой мембраны производства экспериментальной лаборатории р/к Хийу калур пропитывают растворами п-азидобензальдегидацеталя в бензоле с содержанием реагента 90, 45, 22, 11,5 мг/мл. Облучение матриц, иммобилизацию кроличьих антител против фермента пероксидазы ведут, как в примере 1. Поло- ски помещают в раствор, содержащий ПХ в концентрации 3,2 нг/мл в ФБ2, на 45 мин при комнатной температуре. Далее обработку ведут, как в примере 1.

В табл. 4 приведена зависимость длины неокрашенной зоны полосок от концентрации п-азидобензальдегидацеталя. Из данных табл. 4 следует, что увеличение концентрации выше 90 мг/мл и уменьшение ниже 22 мг/мл нецелесообразно.

Пример 5. Полоски бумаги для хроматографии,активированной,как в примере 1, помещают в раствор, содержащий 10 М тиреоглобулина (ТГ) в ФБ1, на 1 ч при комнатной температуре или на 12 ч при4°С. По окончании иммобилизации полоски промывают в ТБ1 в течение 1,5 ч (все описанные далее процессы ведут при комнатной температуре) при аккуратном перемешивании, Затем полоски помещают в раствор блоки- рующего агента (0,5% желатины в ФБ1) на 1 ч для снятия неспецифического связывания.

Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно в течение 1 ч растворами, содержащими антисыворотку к ТГ в разведениях 1:20000; 1:40000; 1:80000; 1:160000; 1:320000 в ФБ2. В контроле содержится неиммунная сыворотка кролика в разведении 1:10000. После промывания полоски помещают в раствор белка А, коньюгированного с ПХ, в концентрации 10 М в ФБ2 на 1 ч. После промывания полоски помещают в раствор субстратов (0,5 мг/мл ДАВ, 0,02% Со2+, 0,004% HzOa в ФБ1). Реакцию останавливают через 5 мин промыванием холодной водой. Измеряют длину неокрашенного участка полоски.

В табл. 5 приведена зависимость длины неокрашенной зоны полоски от концентрации антител к ТГ (величины разведения антисыворотки).

Пример 6. Полоски мембраны МФЦ- (1-4) Владипор, активированной, как в примере 1, помещают в раствор; содержащий белок А из S. aureus штамм Cowan 1 в ФБ1 в концентрации 0,5 мг/мл, на 12 ч при 4°С. По окончании иммобилизации полоски промывают 3 раза по 5 мин при периодическом перемешивании в ФБ2. Здесь и далее все обработки проводятся при комнатной температуре.

Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно в течение 1 ч растворами, содержащими антисыворотку морской свинки к свиному инсулину в разведениях 1:1000, 1:5000, 1:20000, 1:100000 и 1:500000. В контроле содержится неиммунная сыворотка морской свинки в разведении 1:10.

После промывания полоски помещают в раствор инсулина, конъюгированного с пе- роксидазой, в концентрации 200 нг/мл в ФБ2 на 1 ч. После промывания полоски помещают в раствор субстратов, как в примере 5. Реакцию останавливают через 10 мин промыванием водой. Измеряют длину неокрашенного участка полоски.

В табл. 6 дана зависимость длины неокрашенного участка полоски от разведения антисыворотки морской свинки.

Пример 7. Полоски мембраны МФЦ- (1-4) Владипор, активированной, как в примере 1, помещают в раствор, содержащий моноклональные антитела к субъединице хорионического гонадотропина человека в ФБ1 в концентрации 10 М, на 12 ч при 4°С. После окончания иммобилизации полоски промывают 3 раза по 5 мин при периодическом перемешивании в ФБ2. Здесь и далее все обработки проводятся при комнатной температуре.

Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно в течение 1 ч растворами, содержащими хорионический гонадотропин

человека в концентрациях 4800, 1200, 480, 40.0 ед./л в ФБ2.

После промывания полоски помещают в раствор антител к субъединице хориони- ческого гонадотропина человека, конъюги- рованного с пероксидазой, в концентрации М в ФБ2 на 1 ч. После промывания полоски помещают в раствор субстратов, как в примере 5. Реакцию останавливают через 10 мин промыванием водой. Измеря- ют длину неокрашенного участка полоски.

В табл. 7 дана зависимость длины неокрашенного участка полоски от концентрации гормона.

Предложенный метод позволяет прово- дить визуальный количественный анализ биологически а ктивн ых веществ с чувствительностью, не уступающей обычным инструментальным методам ИФА с фотометрической системой детекции.

В клиниках СССР для цели высокочувствительного ИФА используют инструментальные фотометрические методы, поэтому в качестве базового объекта принят прототип, в отличие от которого обеспечивается визуальное количественное определение.

Метод может найти применение в клинической диагностике,сельском хозяйстве, ветеринарии, охране окружающей среды, биотехнологии и т.д.

Формула изобретения Способ визуального иммуноферметно- го анализа биологически активных веществ, включающий активацию пористого носителя, его последовательную обработку раствором биологически активного соединения, раствором меченных пероксидазой специфических антител и выявление окрашенного продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что, с целью определения количественного содержания биологически активного вещества,.активацию носителя проводят путем его обработки бензольным раствором диэтилацеталя п-азидобензаль- дегида с последующим облучением градуированным монотонно увеличивающимся по длине ультрафиолетовым светом до максимальной освещенности Дж-см 2 и обработкой минеральной кислотой, а количественное определение биологически активного соединения проводят измерением длины неокрашенного участка носителя.

Изобретение относится к иммунохимии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных меток. Целью изобретения является количественное определение биологически активных соединений с чувствительностью, достигаемой известными методами ИФА

Таблица 1

Таблица 2

Разведения сыворотки ктиреог- лобулину

20000 40000 80000 160000 320000 Контроль

Разведения сыворотки к инсу- лину

1000

5000

20000

100000

500000

Контроль

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Длина неокрашенного участка, отн. ед.

О

1 3 б

7 8

Таблица 6

Длина неокрашенного участка, отн.ед.

О О 1 4 7 8

13

1718121

14 Таблица 7