Способ иммуноферментного анализа тироксина в сыворотке крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к иммунохимии, точнее к способам иммуноферментно- го определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных меток.

Целью изобретения является упрощение способа за счет визуального количественного определения тироксина в сыворотке крови.

Указанная цель достигается тем, что в способе иммуноферментного анализа тироксина в сыворотке крови, включающем получение активированного носителя посредством обработки реагентом для иммобилизации, иммобилизацию специфических антител на носителе с последующей его инкубацией с исследуемой сывороткой и внесен- ным раствором тироксина, меченного пероксидазой хрена, и количественным выявлением окрашенного продукта перокси- дазной активности, иммобилизацию антител на носителе проводят путем его обработки бензольным раствором диэтилаце- таля п-азидобензальдегида (ДАБА), облучением УФ-светом с освещенностью в пределах - Дж-см 2, раствором минеральной кислоты, а регистрацию осуществляют путем визуального сравнения интенсивности окраски носителя с окраской стандартных образцов.

Способ осуществляют следующим образом.

Пористый материал, например бумагу для хроматографии, пористые мембраны из регенерированной целлюлозы, нейлона и т.д. в виде полосок, пропитывают бензольным раствором ДАБА. Затем подготовленный материал облучают УФ-светом и обрабатывают разбавленным водным раствором минеральной кислоты. Активированную полоску погружают сначала в водный раствор специфических антител, затем в раствор, содержащий определяемое количество тироксина и фиксированное количество коньюгата тироксина с пероксидазой и раствор субстратов, образующих нерастворимый продукт ферментативной реакции, после чего проводят визуальную оценку интенсивности окраски носителя.

Освещенность носителя составляет Дж-см 2 и может быть получена с использованием лампы ДРШ-250 с расстоянием от источника света до облучаемой поверхности 50 см. Под действием света происходит фотохимическая реакция, в результате которой осуществляется ковалент- ное связывание молекул ДАБА с поверхностью носителя.

Последующая кислотная обработка приводит к гидролизу ацетальных групп с

образованием на поверхности реакцион- носпособных альдегидных групп. Для этой цели может быть использована любая минеральная кислота, например соляная, которая выполняет роль кислотного катализатора при снятии ацетальной защиты. Степень активации носителя, т.е. количество альдегидных групп на единицу площади определяется освещенностью со0 ответствующего участка поверхности.

При последующей обработке активированной таким образом поверхности раствором специфических антител происходит их ковалентное связывание через аминогруп5 пы с альдегидными группами носителя. Поверхностная плотность антител пропорциональна количеству альдегидных групп на поверхности. Инкубацию ведут 1-2 ч при комнатной температуре. Нижняя и

0 верхняя границы освещенности обусловлены необходимостью определять уровень тироксина в сыворотке крови в определенном физиологическом диапазоне концентраций. При освещенности менее З Ю Дж ,

5 количество иммобилизованных ковалентно антител недостаточно для определения тироксина, при освещенности более 5 Дж диапазон определяемых концентраций сильно сдвинут в сторону больших концен0 траций тироксина.

При погружении полоски с ковалентно иммобилизованными антителами в анализируемый раствор, на поверхности полоски происходит конкурентное связывание мече5 ного и немеченого (анализируемого) тироксина с иммобилизованными на полоске антителами. Количество меченого тироксина, связанного в иммунокомплекс, определяется концентрацией анализируемого

0 вещества и поверхностной концентрацией иммобилизованных антител.

Для оценки количества связанной пе- роксидазной метки на носителе (а следовательно, уровня тироксина в растворе)

5 полоски обрабатывают раствором диамино- бензидина (ДАБ) и hteOa в присутствии растворимых солей Со (11), в результате ферментативных реакций образуется темно-синий нерастворимый продукт, осажда0 ющ ийся на носителе в местах локализации ферментной метки.

Интенсивность окрашивания полоски обратно пропорциональна количеству определяемого тироксина в растворе и служит.

5 показателем концентрации определяемого соединения в исходном образце.

Таким образом, основными отличительными признаками изобретения являются ковалентная иммобилизация антител на пористом носителе путем активации носителя

диэтилацеталем п-азидобензальдегида, облучением УФ-светом с освещенностью 310 - 5 Дж , действием раствора минеральной кислоты, а регистрацию осуществляют путем визуального сравнения окраски носителя с окраской стандартных образцов.

Использование ДАБА позволяет легко осуществить фотохимическое контролируемое количественное зарождение функционально активных групп для последующей ковалентной иммобилизации специфических антител. Так как количество зарождающихся активных групп определяется только одним параметром-освещенностью, то первое можно легко регулировать, реально создавая участки с заранее заданной концентрацией альдегидных групп на поверхности матрицы. Контролируемое количественное зарождение функциональных групп на поверхности носителя позволяет осуществлять определение тироксина в заранее заданном диапазоне изменения его содержания (например, в нормальном диапазоне или в диапазоне, характерном для гипо- и гипертироидизма).

Совокупность перечисленных отличительных признаков обеспечивает достижение положительного эффекта, который сводится к визуальному количественному определению содержания тироксина. Указанные признаки для решения подобной задачи ранее не использовались, поэтому отвечают критерию существенности новизны.

Пример 1. Бумагу для хроматографии пропитывают раствором ДАБА в бензоле (45 мг/мл). После высушивания бумагу разрезают на полоски и облучают УФ-светом интенсивности 0,5 10 6Джсм 2с 1 втечение 60 с, что соответствует освещенности каждой полоски Дж Полоски промывают спиртом, высушивают и инкубируют в 0,1 М НС 30 мин. Затем их промывают водой и помещают в раствор кроличьих антител против тироксина (10 М) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,14 М NaCI, pH 7,2 (ФБ1), на 1 ч при комнатной температуре или на 12 ч при 4°С. После окончания иммобилизации полсоки промывают в 0,1 М Трис-HCI, содержащем 1 М NaCI, 0,5% Тритона Х-100, 0,2% дезоксихо- лата натрия, рН 9,2 (ТБ1) в течение 1,5 ч (все описанные далее процессы вели при комнатной температуре) при аккуратном перемешивании. Затем полоски помещают в раствор блокирующего агента (5% БСА в ФБ1) на 1 ч для снятия неспецифического связывания.

Пример 2. Полоски регенерированной целлюлозы пропитывают раствором

ДАБА в бензоле (45 мг/мл). Далее аналогично примеру 1.

Пример 3. Полоски нейлоновой мембраны пропитывают раствором ДАБА в

этиловом спирте (45 мг/мл). Далее аналогично примеру 1.

Пример 4. Антитела к тироксину иммобилизуют на полосках бумаги для хроматографии, как описано в примере 1. Каж0 дую полоску носителя обрабатывают отдельно растворами, содержащими соответственно 0, 2, 5, 10, 15 нМ тироксина (исходные растворы разбавляли в 10 раз) и 25 нМ меченного пероксидазой тироксина в

5 ФБ2 (ФБ1, содержащий 0,05% Твина-20) в течение 2ч.

После отмывания полоски помещают в раствор субстратов (0,5 мг/мл ДАБ, 0,02% Со2+, 0,004% Н202 в ФБ1). Реакцию останав-,

0 ливают промыванием полосок холодной водой через 5 мин.

Получают стандартный набор полосок (номера полосок 1-5 соответственно), интенсивность окраски которых, регистрируе5 мая визуально, обратно пропорциональна концентрации немеченного тироксина.

Пример 5. Бумагу для хроматографии пропитывают раствором ДАБА в бензоле (45 мг/мл). После высушивания бумагу разреза0 ют на полоски и облучают УФ-светом интенсивности 0, Дж-см 2 в течение 100 с, что соответствует освещенности каждой полоски ДЖ См 2. Полоски промывают спиртом, высушивают инкубируют в 0,1 М

5 HCI 30 мин. Затем их промывают водой и помещают в раствор кроличьих антител против тироксина (10 М) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,14 М NaCI, pH 7,2 (ФБ1), на 1 ч при комнатной температуре

0 или на 12 ч при 4°С. После окончания иммобилизации полоски промывают в 0,1 М Трис-HCI, содержащем 1 М NaCI, 0,5% Тритона Х-100, 0,2% дезоксихолата натрия. рН 9,2 (ТБ1) в течение 1,5 ч (все описанные

5 далее процессы вели при комнатной температуре) при аккуратном перемешивании. Затем полоски помещают в раствор блокирующего агента (5% БСА в ФБ1) на 1 ч для снятия неспецифического связывания.

0 Примерб. Полоски регенерированной целлюлозы пропитывают раствором ДАБА в этиловом спирте (45 мг/мл), Далее аналогично примеру 5.

Пример 7. Полоски найлоновой

5 мембраны пропитывают раствором ДАБА в бензоле (45 мг/мл). Далее аналогично примеру 5.

Пример 8. Антитела к тироксину иммобилизуют на полосках регенерированной целлюлозы, как описано в примере 6.

Пример 8. Антитела к тироксину иммобилизуют на полосках регенерированной целлюлозы, как описано в примере 6. Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно растворами, содержащими соответ- ственно 0, 10, 15, 30, 60 нМ тироксина (исходные растворы разбавляли в 10 раз) и 25 нМ меченного пероксидазой тироксина в ФБ2 в течение 2 ч.

После отмывания полоски помещают в раствор субстратов (0,5 мг/мл ДАБ, 0,02% , 0,004% Н20. в ФБ1). Реакцию останавливают промыванием полосок холодной водой через 5 мин.

Получают стандартный набор полосок (номера полосок 6-10 соответственно), интенсивность окраски которых, регистрируемая визуально, обратно пропорциональна концентрации немеченого тироксина.

Пример 9. Активацию бумаги для хроматографии и иммобилизацию антител против тироксина ведут, как описано в примере 1.

Полоски помещают в четыре раствора, содержащих неизвестное количество тирок- сина (четыре образца сывороток крови чело- века, анализируемых на содержание тироксина, разбавляли в 10 раз) и 25 нМ тироксина, меченного пероксидазой, Промывание полосок и последующее проявле- ние проводят, как в примере 4.

Визуальное сравнение с результатами стандартных опытов показывает, что первая сыворотка не содержит тироксина, содержание тироксина во второй сыворотке со- ставляет величину около 20 нМ (интенсивность окраски полоски наиболее близка к интенсивности окраски стандартной полоски номеЈ 2). В третьем и четвертом образцах сыворотки гормона содержится более чем 150 нМ. Результаты анализов приведены в табл. 1.

Пример 10. Активацию регенерированной целлюлозы и иммобилизацию антител против тироксина проводят, как в примере 6. Далее полоски бумаги обрабатывают, как в примере 9.

Визуальное сравнение с результатами стандартных опытов (пример 6) показывает, что первый и второй растворы содержат тироксин в концентрации менее чем 100 нМ, Третий и четвертый растворы содержат тироксин соответственно в концентрациях около 150 и 300 нМ, так как по интенсивности окраски полоски наиболее близки к интенсивности окраски полосок 8 и 9, соответственно. Результаты анализов приведены в табл. 2.

Предложенный метод позволяет проводить визуальный количественный анализ тироксина с чувствительностью, не уступающей обычным инструментальным методам ИФА с фотометрической системой детекции.

В клиниках СССР для цели определения тироксина в сыворотке крови используют инструментальные радиоиммунологические и иммуноферментные методы. Поэтому в качестве базового объекта принят прототип, в отличие от которого обеспечивается визуальное количественное определение. Метод может найти применение в клинической диагностике.

Формула изобретения

Способ иммуноферментного анализа тироксина в сыворотке крови, включающий обработку носителя реагентом для иммобилизации, иммобилизацию специфических антител на носителе с последующей его инкубацией с исследуемой сывороткой и внесенным раствором тироксина, меченного пероксидазой хрена, и количественным выявлением окрашенного продукта перокси- дазной активности, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет визуального количественного определения тироксина, носитель обрабатывают бензольным раствором диэтилацеталя п-азидо- бензальдегида, ультрафиолетовым светом с освещенностью в пределах 3-10 5-5-10 5 , раствором минеральной кислоты, и регистрируют путем визуального сравнения интенсивности окраски носителя с окраской стандартных образцов.

Изобретение относится к иммунохимии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных клеток. Целью изобретения является упрощение способа за счет визуального количественного определения тироксина в сыворотке крови. Цель достигается тем, что активацию пористого носителя ведут диэти- лацеталем п-азидобензальдегида с последующим облучением УФ-светом, создающим освещенность - Дж-см 2. Последующая кислотная обработка приводит к образованию на поверхности реакционно- способных альдегидных групп. Количество альдегидных групп на единицу площади определяется освещенностью соответствующего участка поверхности. При последующей обработке активированной поверхности раствором специфических антител происходит их ковалентное связывание через аминогруппы с альдегидными группами носителя. Поверхностная плотность антител пропорциональна количеству альдегидных групп на поверхности. Нижняя и верхняя границы освещенности обусловлены необходимостью определять уровень тироксина в сыворотке крови в определенном физиологическом диапазоне концентраций. При погружении полоски с ковалентно иммобилизованными антителами в анализируемый раствор на поверхности полоски происходит конкурентное связывание меченого и немеченого (анализируемого) тироксина с иммобилизованными на полоске антителами. Количество меченого тироксина, связанного в иммунокомплекс, определяется концентрацией анализируемого вещества и поверхностной концентрацией иммобилизованных антител. Для оценки количества связанной пероксидазной метки на носителе (а следовательно, уровня тироксина в растворе) полоски обрабатывают раствором субстратов, В результате ферментативной реакции образуется темно-синий нерастворимый продукт, осаждающийся на носителе в местах локализации ферментной метки. Интенсивность окрашивания полоски обратно пропорциональна количеству определяемого тироксина в растворе и служит показателем концентрации определяемого соединения в исходном образце. Предложенный метод позволяет проводить визуальный количественный, анализ тироксина с чувствительностью, не уступающей обычным инструментальным методам ИФА с фотометрической системой детекции. 2 табл. (Л С XI 00 N3 О

Таблица 1

1718120

10 Таблица 2