Штамм бактерий ВRаDYRнIZовIUм Sp.(LотUS) для производства бактериального удобрения под лядвенец рогатый Советский патент 1989 года по МПК C05F11/08 

1-, ,: ;;

Изобретение относится к микробио-г логическим средствам повышения урожая бобовых культур и представляет . собой штамм клубеньковых бактерий для инокуляции лядвенца рогатого.

Цель изобретения - получение нового штамма клубеньковых бактерий, повышающего при инокуляции лядвенца рогатого урожай зеденой массы и co-v держание в ней общего азота.

Штамм Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476 вьщелен из клубеньков лядвенца рогатого.

Штамм клубеньковых бактерий лядвенца рогатого Bradyrhizobium sp, (Lotus) депонирован и хранится в коллекции ВНИИСХМ под № 476,

Культурально-морфологические признаки штамма Bradyrhizobium sp, (Lotus) 476.

Культивировать штамм можно на гороховом, люпиновом и маннитно- дрожжевом агаре.

1. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; агар-агар 20,0; рН среды 6,8-7,0.

Величина клеток 2-суточной культуры на гороховом агаре 1,2-1,9x0,6- 0,9 мкм. Короткие папочки, слегка изогнутые подвижные в молодом возрасте. Перитрихи. Бактероиды имеют вильчатую форму. Грамотрицательные. Медленно растущая культура.Штрих обильный,ели- зистый,бесцветный.Колонии однотипные.

«

сл

00 Сдд

СП

;0

беловатые,круглые,слизистые,с четкими краями,3-5 мм в диаметре,появляются на 4-е сутки.

2. Люпиновый агар г/л: Of5; KHjPO 0,5; MgS04 7H20 0,2; NaC10,2; CaS04 0,1 ; (NH4)2Mo04 - следы; маннит 20,0; люпиновая мука 10,6; агар-агар 20,0; рН среды 6,8-7,0.

2.приготовление жидкой рабочей культуры; .

3.подготовка торфа и его гамма стерилизаций;

4.заражение торфа рабочей куль турой;

5.подращивание бактерий в торф Приготовление жидкой посевной ку

...с-- f - v«.i.i-iti yivjn/ zvwn ии -съпии к

Штрих Обильный, СЛИЗИСТЫЙ, белова-10 туры. Жидкую культуру вьфащивают в

Г . KOrfrtWMM ОТ НГОТЧЛ-ЩЫ/ Arr. л

тый. Колонии отнотипные, беловатые, круглые, слизистые, слабо растекающи- etK, 4-5 мм в диаметре, появляются на 4-е сутки. ..

3. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; К НР040,5| MgSO -7Н-гО 0,2; NaCl дрожжевой экстракт 0,4; агар-агар 15,0; рН среды 6,8- 7,0.

Штрих обильный, слизистый, бесцветный, стекающий. Колонии однотипные, беловатые, круглые, слизистые, растекающиеся, 4-6 мм в диаметре,появляются на 4-е сутки.

Физиолого-биохимические признаки штамма Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476.

Молоко с лакмусом не пептонизиру- ет, подщелачивает с образованием сли- I зистой зоны на поверхности. Желатину I не разжижает Аэроб. Оптимальная тем- } пература 26-28°G.

Отношение к углеводам. Используе- . мые многие углеводы с подкислением I среды. Хорошо растет на средах с глю I козой, галактозой, маннитом, рамно- j ЗОЙ, менее активно - с декстрином, сахарозой, мальтозой, лактозой, слабо/- с ксилозой и сорбитом. Клетчатку и крахмал не усваивает.

I

Отношение к источникам азота. Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями,, тирози- ном. На МПА бактерии не растут. Призкачалочных колбах и в пятилитровых б тьшях в течение 2 сугок на среде сл дующего состава, мае. %: гороховый отвар 10,0; сахар (пищевой) 1,0;

15 (NH4)iS04 0,05; 0,05; .х X 0,5; MgS04«7H,0 0,2; CaCOj-0 вода водопроводная - остальное. рН после, стерилизации 6,8-7,0. Титр 5-8 млрд./мл. ..

20 Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культу в пятилитровых бутьшях или фермента торах на среде следующего состава, мае. %: кукурузный экстракт 1,0; ме

25 ласса2,0; (NH) S04;0,1; 0,025 3H,jO 0,025; MgSO г7Н 0 0,0 СаСОз 0,1; вода водопроводная - остальное. рН после стерилизации 6,8- 7,0.

30 . Бутьши и ферментаторы засевают п севной культурой клубеньковых бакте рий в количестве 5%. Бутыли встряхи вают на качалке в течение 40-48 ч. В ферментаторах бактерии выращивают

35 18-36 ч при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 ат при 28-30 0. Титр не менее 5 млрд./м После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей

40 Или ферментаторов - инокулюм - используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,2 с влажностью 30-40% в

-- v,v ,«. f- cjld UlUUTbiU JU-Чил В

наки штамма устойчивы. Штамм не пато- g полиэтиленовых пакетах до 200-400 г

Г РНРН .- Упянм гг ет ма n rsrtvrtortu т ч«чл

генен.- Хранится на гороховом агаре при 4-5° и пересевается один раз в 6 месяцев. Штамм Bradyrhigbbium sp. (Lotus) 476 идентифицирован по определению Bergey s Manual, of sistematic bacteriology, 198.4.

Методика приготовления препарата для инокуляции лядвенца рогатого на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476.

Технология получения препарата включает следующие операции:

1. приготовление Лидкой посевной культуры;

стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный тррф в . пакетах инокулируют инъекцией смеси культуральная жидк ость + меласса (6Z

gQ из расчёта исходного титра, бактерий 0,3-0,5 млрд.,/г .торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое

gg Культуру в торфе подращивают выдерживая пакеты 3-5 суток при 15-20 затем пакеты хранят при температуре 3-8 С в темном сухом помещении, о дельно от ядохимикатов.

2.приготовление жидкой рабочей культуры; .

3.подготовка торфа и его гамма- стерилизаций;

4.заражение торфа рабочей культурой;

5.подращивание бактерий в торфе. Приготовление жидкой посевной кул

f - v«.i.i-iti yivjn/ zvwn ии -съпии к

туры. Жидкую культуру вьфащивают в

туры. Жидкую культуру вьфащивают в

качалочных колбах и в пятилитровых буг тьшях в течение 2 сугок на среде следующего состава, мае. %: гороховый отвар 10,0; сахар (пищевой) 1,0;

(NH4)iS04 0,05; 0,05; .х X 0,5; MgS04«7H,0 0,2; CaCOj-0,1; вода водопроводная - остальное. рН после, стерилизации 6,8-7,0. Титр 5-8 млрд./мл. ..

Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры в пятилитровых бутьшях или фермента- - торах на среде следующего состава, мае. %: кукурузный экстракт 1,0; меласса2,0; (NH) S04;0,1; 0,025; 3H,jO 0,025; MgSO г7Н 0 0,02 ; СаСОз 0,1; вода водопроводная - остальное. рН после стерилизации 6,8- 7,0.

. Бутьши и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встряхи вают на качалке в течение 40-48 ч. В ферментаторах бактерии выращивают

18-36 ч при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 ати при 28-30 0. Титр не менее 5 млрд./мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей

Или ферментаторов - инокулюм - используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,2 с влажностью 30-40% в

v,v ,«. f- cjld UlUUTbiU JU-Чил В

полиэтиленовых пакетах до 200-400 г

g полиэтиленовых пакетах до 200-400 г

стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный тррф в . пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидк ость + меласса (6Z

gQ из расчёта исходного титра, бактерий 0,3-0,5 млрд.,/г .торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое.

gg Культуру в торфе подращивают выдерживая пакеты 3-5 суток при 15-20 С, затем пакеты хранят при температуре 3-8 С в темном сухом помещении, о дельно от ядохимикатов.

10

15

20

51458359

Характеристика готового продукта. Ризоторфин для лядвенца на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворяемую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 4-6 млрд. клубеньковых бактерий на 1 г препарата. Срок годности препарата 6 месяцев со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян. .

Технология предпосевной инокуляции семян лядвенца.

Для инокуляции семян лядвенца в Вегетационных опытах выращивали чистую культуру предлагаемого штамма на скошенном гороховом агаре. Культуру смьгоалИ водопроводной йодой и наносили на семена лядвенца, разложенные .в лунки в цочве каждого сосуда. В сосуд вносили 10 клеток.

В полевых опытах семена лядвенца обрабатывали торфяным препаратом - ризоторфином, изготовленным на штамме 476. Для этого 200 г препарата разводили в 1 л водопроводной воды,и не давая суспензии отстаиваться, наносили ее на гектарную норму семян (10 кг/га). Затем семена тщательно перемешивали до равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевали в тот же день во влажную почву.

Методика проведения вегетационных 35 и полевых опытов. Вегетационные опыты проводили в сосудах с 6 кг дерно- .во-подзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, но без азота. Повторноеть опыта 4-кратная, Использован районированный сорт ляд- венца рогатого Вёсело-Подолянский;

Полевые опыты проводили на хоро- шо окультуренных дерново-подзолистых почвах. Площадь делянки 50 м. Пов- торность 4-кратная.

25

30

40

45

дл то

го са

та

де бак не выс лиш рас бен

сим Bra дел опы мас в н со при ляд дящ ции

при

бак фик с л уро риз вьш1 Сод в в уве общ бак 2,8 ных

Применение препарата на основе штамма Bradyrhizobium sp.(Lotus) 476 для инокуляции лядвенца рогатого. ; Пример l.iB вегетационном опыте с лядвенцем рогатым бьшо проведено сравнение эффектив ности штамма Bradyrhizobium sp.(Lotus) 476 со штаммом клубеньковых бактерий, используемым для получения препарата под горох Rhizpbium leguminosarum 250а (штаммов клубеньковых бактерий

0

5

0

5

0

для повьш1ения урожая лядвенца рога- того пока не предложено). ,

Методика проведения опытов и приготовления препарата аналогична описанной.

- Данные по примеру 1 приведены в табл. 1.

Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что клубеньковые бактерии из группы R. ieguminosarum не эффективны на л ядвенце рогатом, высокая прибавка урожая получена лишь в варианте с инокуляцией этого растения специфичными для него клубеньковыми бактериями лядвенца.

Пример 2. Эффективность симбиотической азотфиксащш у штамма Bradyrhizobium sp..(Ldtus) 476 определена в вегетационных и полевых опытах по величине урожай зеленой массы лядвенца рогатого и накопление в ней азота или протеина в сравнении со спонтанным заражением растений природной популяцией специфичных для лядвенца клубеньковых бактерий, находящихся в почве (вариант без инокуляции) .

Результаты , вегетационных опытов приведены в табл. 2.

5

0

5

0

5

Как видно из табл. 2, клубеньковые бактерии лядвенца штамма 476 активно фиксируют атмосферный азот в симбиозе с лядвенцем рогатым,в результате.чего урожай зеленой массы растений, бактеризованных этим штаммом, на 32-50% вьш1е, чем у растений без инокуляции. Содержание общего азота у растений в варианте с инокуляцией штаммом 476 увеличивается на 0,47-0,99%. В итоге общее накопление азота у растений, бактеризованных штаммом 476, в 1,6- 2,8 раза вьше, чем у неинокулирован- ных.

Пример 3. Эффективность штамма 476 была определена в полевьпс опытах на районированных сортах лядвенца.

Результаты опытов представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, предлагаемый штамм обеспечивает повьш1ение урожая зеленой массы лядвенца рогатого в среднем на 37,4 цУга (33,0%) и увеличение содержания в урожае протеина в среднем на 1,0%.

Таким образом, получен новый штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus) ВНИИСХМ № 476, повьшающий при инокуляции урожай зеленой массы и содержание в ней общего азота ляд- венца рогатого.

8

рмула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhizobium J sp. (Lotus) ВНИИСХМ № 476 для npoH3t водства бактериального удобрения под лядвенец рогатый.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения под бобовую культуру лядвенец рогатый. Целью : изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий, повышающего при инокуляции лядвенца рогатого, урожай зеленой массы и содержание в ней общего азота. Штамм Bradyr- hizobium sp. (Lotus) выделен из клу-.. 6eHbkoB лядвенца рогатого. Штамм Bradyrhizobium sp, (Lotus) депонирован и хранится в колллекции ВНИИСХМ под № 476. Новый штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Lotus) ВНИИСХМ № 476 по сравнению со неино- кулированньм контролем (спонтанной природной популяцией) в вегетационных опытах повышает урожай зеленой массы лядвенца рогатого на 32,9-50,6% и содержание общего азота на 0,47-1,35%, в полевых - урожай зеленой массы на 25,1.-35,5%. 3 табл. (Л С

Таблица

Сравнительная эффективность штаммов Bradyrhizobium sp. 476 и Rhizobium leguminosarum 250а при. инокуляции лядвенца рогатого

Р 2,8%; НСРо,5 1,0 г/сое.

Эффективность симбиотииеской азотфиксации штамма Bradyrhizobium sp. (Lorus) 476 в вегетационных опытах

Весело-Подо- лянский

Гельсвис

Без ино-16,8 куляции

Шт. 47625,8

Без ино-16,1 куляции

Шт. 47621,4

5,3 32,9 2,47 529

Таблица 2

1,9

1,8

1,4

1,2

ТаблицаЗ Эффективность штамма Bradyrhizobium sp. (Lotus) 476 в полевых опытах

Московский

Веэ ино- 55,0 куляции

кий

Шт. 476 67,8 13,8 25,1 16,6 0,5

12,2

61,0 35,5 12,8 1,6 14,2

37,4 33.0 15.2 1,0

Beis ино- 162

куляции

Шт. 476 233

Вез ино- 113,5 куляции

Шт. 476 150.9

16,1

8,0 6,5

4,2 8,8