Способ определения альбумин-глобулинового коэффициента крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/52 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а точнее к клинической биохимии, и касается определения альбумин-глобулинового коэффициента (АГК) в плазме или сьГворотке крови с диагностической целью. АГК - величина, выражающая отношение количества альбуминов к количеству глобулинов в биологических жидкостях. В норме АГК крови колеблется в пределах 1,2-2,0. При разнообразных патологических состояниях (хронические инфекции, заболевания печени, почек, ожоги, воспаления и т.д.) наблюдается снижение АГК крови - и это служит важным диагностическим признаком.

Цель изобретения-упрощение способа при одновременном повышении его чувствительности. .

Способ осуществляется следующим образом.

. Пробу крови разводят в 50-1000 раз, отделяют форменные элементы, из полученного раствора плазмы готовят четыре пробы, в которых измеряют интенсивность флуоресценции (ее величины обозначены как Е:, Б, С и Д) и рассчитывают АГК по формуле

АГК

Е -D Б -С

К-2

(D.

где Е - интенсивность собственной флуоресценции разбавленной плазмы;

Б-тоже, в присутствии М-фенил-1-ами- но-8-сульфонафталина (АНС) в конечной концентрации 20-60 мкМ;

С - интенсивность флуоресценции 10- 50 мкМ раствора триптофана;

Д-то же в присутствии 20-60 мкМ АНС; . К-числовой коэффициент, который при средней концентрации АНС 40 мкм составляет величину 2,13.

Коэффициент К связан с концентрацией АНС следующим уравнением: .

К 2,25(1 -0.0013 Н).

где Н - концентрация АНС в мкМ.

Обычно используют концентрацию АНС 40 мкМ, и в уравнениях расчета АПК используют коэффициент, равный 2,13. В интервале концентраций 20-60 мкМ даже при использовании постоянного коэффициента (2,13) ошибка определения АПК находится в пределах ±7%. Если же использовать переменный коэффициент, то значения АГК получаются практически одинаковые. Результаты приведены в таблице.

В предлагаемом способе можно также использовать цельную плазму или сыворотку, которую перед измерениями необходи- мо развести в 100-2000 раз (это соответствует разведению крови в 50-1000 раз).

Для проведения анализа в зависимости от степени разведения достаточно 2-40 мкл крови, или 1-20 мкл сыворотки или плазмы (в известном способе - 110 мкл). Это повышает чувствительность по сравнению с известным способом в 5-110 раз. При дальнейшем разведении снижается сигнал, а следовательно, и точность измерения. Разведение крови менее, чем в 50 раз нецелесообразно, так как требует большего объема крови, и, следовательно, приводит к снижению чувствительности способа.

АНС используется в способе в качестве тушителя собственной флуоресценции альбумина. Конечная концентрация АНС в анализируемой пробе 20-60 мкМ, оптимальная концентрация - 40 мкМ.

В предлагаемом способе с целью стандартизации процедуры анализа используется раствор триптофана (10-50 мкМ). Измерения интенсивности флуоресценции в растворе триптофана для каждого конкретного прибора и измерительной кюветы достаточно провести один раз. Время проведения одного анализа с момента получения разбавленной плазмы или сывбротки - 1-2 мин.

Приме р 1. В 30 образцах плазмы по предлагаемому способу было определено

соотношение альбумин/глобулин. С этой целью к 5 мкл плазмы каждого образца добавляют 1 мл буферного раствора следующего состава: трмс-(оксиметил)-аминометан 10 мМ, ЭДТА 2 мМ, №CI 145 мМ, рН 7,4,

0 измеряют интенсивность флуоресценции . разбавленной плазмы до (Е) и после (Б) добавления 40 мкМ АНС. Измеряют интенсивность флуоресценции 40 мкМ раствора триптофана до (С) и после (Д) добавления 40

5 мкМ АНС. По формуле (1) и К 3.13 рассчитывают значения АГК. Среднее значение в труппе составило 1.40. Измерения проводят при следующих условиях: длина волны возбуждения 285 нм, длина волны флуоресцен0 ции 340 нм, расстояния между внутренними поверхностями прямоугольной кюветы 1 см. Параллельно в этих образцах крови вычислены значения АГК с помощью известного способа среднее значение 1,41). Коэффици5 ент корреляции между данными обоих способов составляет 0,92. При изменении концентрации АНС на 10 мкМ (25%) и использовании постоянного коэффициента К 2,13 определяемое значение АГК изменяет0 ся на 0,05 единиц (3-4%). Следовательно, небольшие вариации в концентрации АНС слабо повлияют на точность анализа. Коэффициент (К) в уравнении (1) зависит от концентрации АНС и при 40 мкМ равен 2,13.

5 Если ввести поправку на концентрацию, то точность способа будет еще выше.

Предлагаемый способ позволяет значительно упростить и ускорить определение АГК. Проведение одного анализа (вместо двух

0 в известном способе)с использованием одного флуоресцентного красителя (вместо набора реактивов ) приводит к упрощению способа, а сокращение времени инкубации красителя с образцом с 35-70 мин (в изеест5 ном способе) до 0,5-1,0 мин (в предлагаемом способе)- к сокращению времени анализа до 1-2 мин. При этом происходит значительная экономия красителя - для проведения анализа требуется в 10 раз меньшее количество

0 красителя, чем для определения альбумина по известному способу.

Кроме того, повышается чувствительность анализа по сравнению с известным способом в 5-110 раз за счет использования

5 микроколичества крови (2-40 мкл),

Положительные эффекты достигаются

без уменьшения точности определения АГК.

Формула изобретения

Способ определения альбумин-глобулинового коэффициента крови, включающий

получение плазмы или сыворотки крови, добавление к ней красителя с последующим анализом оптических свойств исследуемого и контрольного образцов, отличающий- с я тем, что, с цельюупрощения способа при одновременном повышений его чувствительности, в качестве красителя используют М-фенил-1-амино-8-сульфонафталинв концентрации 20-60 Mxlvf, измеряют интенсивность собственной флуоресценции в контрольном образце, содержащем триптофан, и в исследуемом образце, содержащем сыворотку или плазму до и после добавления красителя, а альбумин-глобулиновый коэффициент рассчитывают по формуле Е -Д.

АГК

Б -С

К-2.

где АГК - альбумин-глобулиновый коэффициент;

Е - интенсивность собственной флуо- ресценции плазмы или сыворотки крови;

Б-интенсивность флуоресценции плазмы или сыворотки в присутствии красителя;

С - интенсивность флуоресценции кон- трольного образца, содержащего триптофан; ;:.. ; . -...- : . . .Д - флуоресценция образца, содержащего триптофан в присутствий красителя: К - числовой коэффициент, зависящий от концентрации красителя.

Изобретение, относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и касается определения альбумин-глобулинового коэффициента (АГК) в плазме или сыворотке крови. Цель изобретения - упрощение способа пр.и одновременном повышении его чувствительности. Кровь, плазму и сыворотку разводят буферным раствором/, отделяют (в случае крови) форменные элементы, добавляют флуоресцентный .краситель фенил-1-амино-8-сульфонафталин (АНС), измеряют интенсивность собственной флуоресценции в исследуемом и контрольном образцах до и после добавления АНС и рассчитывают величину АГК по формуле. В качестве контрольного образца используют раствор триптофана. Для проведения анализа по описанному способу достаточно 2- 40 мкл крови или 1-20 мкл плазмы или сыворотки (т.е. чувствительность возрастает на 1-2 порядка), нет необходимости в проведении раздельного определения количества альбумина и глобулинов. Время анализа одной пробы по предлагаемому способу .1-2 мин. сл