Среда для окрашивания глутатион-редуктазы на срезах тканей Советский патент 1992 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической химии, а также для выявления локализации, распределения и количества глутатион-ре- дуктазы в органах и тканях человека и животных в норме, при различных воздействиях и в целях диагностики.

Целью является повышение специфичности реактива и полного определения фермента.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения предлагаемого реактива в 80 мл бидистиллированной воды растворяют 0,3-20,0 мг четыреххлористоводородной соли золота (раствор А), затем в 20 мл биди- стиллированной воды растворяют 50-200,0 мг цитрата натрия (раствор Б), после чего растворы А и Б сливают и нагревают смесь до 100°С. Раствор приобретает стабильную рубиновую окраску, его охлаждают. Сывороточный альбумин в концентрации конечного раствора 0,5-5,0 мг/мл и окисленный глутатион (0,5-5,0 мг/мл конечной концентрации) растворяют в дистиллированной воде. Затем эту смесь приливают к раствору коллоидного золота в соотношении 1:(6-9). Полученную смесь центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч. Супернатант удаляют и реактив, находящийся в виде неплотного осадка на дне центрифужной пробирки, ре- суспендируют в минимально возможном объеме супернатанта. Хранится реактив в замороженном состоянии.

Пример 1. Для определения глутати- он-редуктазы использовали реактив, приготовленный при следующем соотношении компонентов, мас.%: четыреххлористоводо- родная соль золота 0,003; цитрат натрия 0,5; окисленный глутатион 0,005; сывороточный альбумин 0,005; вода -до 100 мл.

Для гистологического исследования брали ткани желчного мешка и печени крыс, фиксировали в 4%-ном растворе парафор- мальдегида и после обычной гистологической проводки заливали в парафин-воск. . Изготавливали полутонкие срезы, монтировали на стеклах, депарафинировали и регидсл

С

-ч

ю

Ј

о

00

ратировали обычными способами, затем наслаивали полученный реактив и оставляли на ночь во влажной камере при комнатной температуре.

Результаты исследования.

Отчетливо видна локализация расположения глутатион-редуктазы по дольке. Цен- тролобулярные районы имеют более интенсивное красное окрашивание. Окрашивание локализуется на границе материнских и плодовых тканей.

Для электронно-микроскопического исследования аналогичные ткани фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида и после обычной электронно-микроскопической проводки заливали в эпонаралдит, из- готавливали ультратонкие срезы, монтировали их на медных сетках и оставляли плавать в капле реагента на ночь. Материал исследовался в электронном микроскопе. В результате в желчном мешке крысы фермент расположен на границе материнских и плодовых тканей, в печени крыс - во вторичных лизосомах. В первичных лизосомах фермент отсутствует.

Для контроля специфичности окрашивания реактивом на срезе ткани ставили следующие реакции контроля: наслоение на срез ткани раствора альбумина, меченного коллоидным золотом; блокирование активных центров глутатион-редуктазы в срезе ткани нанесением раствора окисленного глутатиона, а затем воздействие реактивом; неспецифическая ингибиция редуктаз при помощи перикиси водорода.

В первом случае на срез ткани на ночь наслаивали концентрированный раствор альбумин-коллоидное золото. Во втором случае на срез ткани наслаивали окисленный глутатион в дистиллированной воде в количестве 10-20 мг/мл и выдерживали в течение 12 ч. Затем наслаивали полученный реактив и выдерживали в течение 10 ч. В третьем случае на срез ткани наслаивали

5%-ный раствор перекиси водорода в метиловом спирте на 1 ч, а затем наслаивали реактив на 12 ч. Окраска не всегда подавлялась полностью. В контроле окрашивание полностью отсутствовало.

Предлагаемая среда находит широкое применение при диагностике различных заболеваний, связанных с нарушением процессов перекисного окисления (опухолевых, воспалительных, склеротических), при

оценке экспериментального материала, особенно при сопоставлении биохимических и морфологических данных. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Среда для окрашивания глутатион-редуктазы на срезах тканей, содержащая че- тыреххлористоводородную соль золота и цитрат натрия и воду, отличающаяся тем, что, с целью полного выявления фермента в ткани, среда дополнительно содержит окисленный глугатйон и сывороточный альбумин при следующих соотношениях компонентов, мас.%: четыреххлористоводо- родная соль золота 0,003-0,2; цитрат натрия 0,5-2,0; окисленный глутатион 0,005-0,05;

сывороточный альбумин 0,005-0,05; вода - остальное.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования. Целью изобретения является полное выявление фермента в ткани. Цель достигается тем, что инкубационная среда дополнительно содержит окисленный глутатион и сывороточный альбумин при следующих соотношениях, мас.%: четырех- хлористоводородная соль золота 0,003-0,2; цитрат натрия 0,5-2,0; окисленный глутатион и сывороточный альбумин по 0,005-0,05 и вода - до 100. Среда позволяет полно выявить фермент во всех структурах ткани.