СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/532 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования различного материала на наличие возбудителя бруцеллеза и его антигенов.

Несмотря на то, что в практике здравоохранения используется ряд методов обнаружения антигенов бруцелл, все они не лишены тех или иных недостатков, поэтому усовершенствование существующих и разработка новых современных методов диагностики бруцеллеза остается актуальной задачей.

В последнее время в практических лабораториях довольно часто используется иммуноферментный метод как для обнаружения различных инфекционных агентов, так и для выявления специфических антител, предполагающий использование в качестве твердой фазы полистироловых микротитровальных планшетов (Меринов С.П., Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Захлебная О.Д., Лаукнер И. В. , Грачева Н.Ж., Широков В.А., Коха А.М. Методические рекомендации по обнаружению возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом. - Иркутск, 1984, - 7 с.). Этот метод обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, однако имеет ряд существенных недостатков. К их числу относятся использование канцерогенных субстратов, нестабильность фермента, фоновое окрашивание в лунках при исследовании биологических субстратов, содержащих эндогенную пероксидазу, что обусловливает необходимость использования приборов - ридеров для учета результатов реакции.

Наиболее близким к предлагаемому является способ обнаружения антигенов бруцелл с помощью противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным золотом (Загоскина Т. Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Журн. микробиол. - 1998. - 6. - С. 64-68). Однако данный способ имеет следующие недостатки: предполагает использование дорогостоящих (импортных) реактивов и оборудования (ультрацентрифуги).

Цель изобретения - удешевление и повышение доступности способа обнаружения антигенов бруцелл.

Поставленная цель достигается тем, что для проведения анализа используют твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, на которую адсорбируют исследуемый образец, не связавшийся материал дважды отмывают 0,02 М фосфатным буфером (ФБ) рН 7,2 с 0,15 М NaCl и 0,05% твина 20 (отмывающий р-р), свободные сайты связывания на подложке инактивируют в течение часа 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБ, далее подложку обрабатывают в течение 50-60 мин противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром, твердую фазу дважды (до и после обработки меченными антителами) промывают отмывающим р-ром и один раз - дистиллированной водой. Конечную обработку подложки осуществляют в течение 10 минут реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду при следующем соотношении компонентов, г: метол - 0,2; лимонная кислота - 0,5; азотнокислое серебро - 0,2; дистиллированная вода - 100. Затем ее промывают и высушивают на воздухе.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что используют твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, удаление не связавшегося с ней материала проводят отмывающим р-ром, свободные участки связывания на подложке инактивируют 2%-ным раствором БСА на ФБ в течение часа. Далее подложку обрабатывают в течение 50-60 мин противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром, промывание подложки до и после обработки меченными антителами проводят дважды отмывающим р-ром и один раз - дистиллированной водой, а конечную обработку осуществляют в течение 10 минут реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду при следующем соотношении компонентов, г: метол - 0,2; лимонная кислота - 0,5; азотнокислое серебро - 0,2; дистиллированная вода - 100. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ обнаружения антигенов бруцелл, который осуществлялся бы на твердых пористых подложках с применением в качестве диагностикума противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром. Предлагаемые режимы проведения анализа позволяют достичь поставленной цели - удешевить и повысить доступность способа обнаружения антигенов бруцелл. При этом он экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность получаемых результатов. Данный способ обнаружения антигенов бруцелл может быть использован в клинических, ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся диагностикой бруцеллеза.

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения антигенов бруцелл соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ обнаружения антигенов бруцелл выполняется следующим образом: исследуемый материал, предположительно содержащий антигены бруцелл, наносят в виде капель на полоску твердой пористой подложки с размером пор 0,17-0,45 мкм (нитроцеллюлозные мембраны, фильтры "Synpor", Чехия). После полного впитывания материала (высыхание при комнатной температуре в течение 20 мин) подложку помещают в чашку Петри и дважды промывают отмывающим р-ром для удаления несвязавшегося материала. Свободные участки иммунологически активной твердой фазы "забивают" в течение 1 часа инертным белком - 2%-ным раствором БСА на ФБ, после чего дважды промывают отмывающим р-ром. Иммунное проявление адсорбированного на подложке антигена осуществляют обработкой раствором противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром, в течение 50-60 мин при легком встряхивании. После двукратного отмывания отмывающим р-ром и однократного - дистиллированной водой подложку погружают на 10 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимых или корпускулярных антигенов бруцелл) и в случае содержания в исследуемых образцах антигенов возбудителей бруцеллеза формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость, суспензии здоровых животных, не инфицированные объекты окружающей среды и т. п. ) и при отсутствии антигенов бруцелл в образцах формирования окрашенных пятен не наблюдается, подложка остается чистой. После выдерживания твердофазного носителя в реактиве с метолом, лимонной кислотой и азотнокислым серебром допускается появление небольшого фонового окрашивания его поверхности в бледно-серый цвет, которое при последующем высушивании полностью исчезает.

Пример 1. Смыв с шерсти животного, содержащий корпускулярные антигены бруцелл, наносят в виде капель на полоску нитроцеллюлозной мембраны с размером пор 0,45 мкм. После полного впитывания материала (высыхание образца при комнатной температуре в течение 20 мин) мембрану помещают в чашку Петри и дважды промывают отмывающим р-ром. Свободные активные участки мембраны "забивают" в течение 1 часа 2%-ным раствором БСА на ФБ, после чего дважды промывают отмывающим р-ром. Иммунное проявление адсорбированного на мембране антигена осуществляют обработкой раствором противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром, в течение 50 мин при легком встряхивании. После тщательного двукратного промывания отмывающим р-ром и однократного дистиллированной водой мембрану погружают на 10 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В исследуемом образце (смыве с шерсти животного) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация корпускулярных антигенов бруцелл) формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдается, мембрана остается чистой. После выдерживания мембраны в проявляющем реактиве допускается появление небольшого фонового окрашивания ее поверхности в бледно-серый цвет, которое при последующем высушивании мембраны полностью исчезает. Чувствительность анализа составляет ≥6,1•10⁴м.к./мл корпускулярных антигенов бруцелл.

Пример 2. Исследуемый раствор, содержащий липополисахарид бруцелл, наносят в виде капли на полоску фильтра фирмы "Synpor" (Чехия) с размером пор 0,17 мкм. После полного впитывания материала (высыхание образца при комнатной температуре в течение 20 мин) фильтр помещают в чашку Петри и дважды промывают отмывающим р-ром. Свободные активные участки фильтра "забивают" в течение 1 часа 2%-ным раствором БСА на ФБ, после чего дважды промывают отмывающим р-ром. Иммунное проявление адсорбированного на фильтре антигена осуществляют обработкой раствором противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром в течение 60 мин при легком встряхивании. После тщательного двукратного промывания отмывающим р-ром и однократного - дистиллированной водой фильтр погружают на 10 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем его промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В исследуемом растворе, содержащем липополисахарид бруцелл, и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимого антигена бруцелл) формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательном контроле (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдается, фильтр остается чистым. После выдерживания в проявляющем реактиве допускается появление небольшого фонового окрашивания поверхности фильтра в бледно-серый цвет, которое при последующем его высушивании полностью исчезает. Чувствительность анализа составляет ≥9 нг/мл растворимых антигенов бруцелл.

Указанный способ обнаружения антигенов бруцелл использован при анализе 250 проб (штаммы бруцелл всех известных видов, имеющихся в лаборатории, искусственно контаминированные объекты внешней среды, растворимые антигенные фракции, изолированные из бруцелл, материал от больных людей и экспериментальных животных).

Исследование материала, содержащего антигены бруцелл, параллельно проводили в дот-иммуноанализе с IgG, меченными коллоидным золотом. Отмечено совпадение результатов по чувствительности и специфичности. Однако предлагаемый способ обнаружения антигенов бруцелл дешевле, доступнее, не требует использования дорогостоящих реактивов.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ осуществляется путем адсорбции на твердую подложку исследуемого образца. Свободные сайты связывания на подложке инактивируют и далее подложку обрабатывают противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром. Далее подложку обрабатывают реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду. Способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность полученных результатов. Способ характеризуется демонстративностью, экспрессностью, доступностью и простотой исполнения.

Способ обнаружения антигенов бруцелл, включающий фиксацию исследуемого материала на твердой пористой подложке в течение 20 мин, двукратное ее промывание 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20, инактивацию свободных участков связывания на подложке раствором бычьего сывороточного альбумина, двукратное ее промывание 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20, обработку подложки специфическим IgG, меченным коллоидным металлом, конечную обработку подложки раствором, содержащим соль серебра, и последующее промывание подложки в воде, отличающийся тем, что используют подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, свободные участки связывания на ней инактивируют 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 60 мин, обработку подложки осуществляют противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром, затем подложку дважды промывают 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20 и дополнительно дистиллированной водой, а в качестве реактива для конечной ее обработки используют раствор, содержащий метол, лимонную кислоту и азотнокислое серебро при следующем соотношении компонентов, г:
Метол - 0,2
Лимонная кислота - 0,5
Азотнокислое серебро - 0,2
Дистиллированная вода - 100
при этом подложку инкубируют в растворе в течение 10 мин, после чего ее промывают проточной водой и высушивают.