Способ получения аденозин-5 @ -трифосфата, меченного изотопами фосфора в @ -положении Советский патент 1992 года по МПК C07F9/09 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения адено- зим-54 у-32(33)Р)-трифосфэтг(( (33) Р)АТР), который широко применяется в биохимических и молекул яр но-биоп отческих исследованиях.

Известны различные способы получения ( y-32 33V)ATP: химические, ферментативные. Как правило, все современные методы дают высокие (более 90%) выходы целевого продукта. Однако, фактически ЕЮ всех случаях используются досрочно сложные реакционные смеси, затрудняющие очистку продукта реакции

Наиболее близким по техническому pt ;je- нию является способ получения f у - PV IP, описанный Авроном. Метод основан на использовании фотозависимого синтеза AIP з хлоропластах растений. Реакционная смесь содержит всего несколько компонентов, причем один из них - хлоропласты - достаточно просто удаляется из реакционной смеси путем обычного центрифугирования. Дальнейшая очистка полученного таким образом ( у- Р)АТР значительно упрощается. Однако, метод позволяет получать продукт с выходом не более 75% от исходного Pi и применим лишь для получения небольших порций радиоактивного продукта. Это обусловлено тем, что в качестве кофактора реакции использовали феррп цианид. Известно, что фотосинтетическзя ект ронтранспортная цепь (ЭТЦ), работа которой обеспечивает энергией синтез AT Р, включает две фотореэкции, так называемые фотосистемы 1 и 2.

Аппарат фотосистемы 2, основной функцией которого являего фоторазложение воды, имеет лабильную структуру. Вспедст- вие этого полная 3 ГЦ улоропласгов повреждается. При использовании ферри- цианида в качестве акцептора электронов донором электронов является водэ, то есть работает полная ЭТЦ. Низкая эффективность работы ЭТЦ с этим кофактором не позволяет получить подукт с выходом более 75% даже при лабораторном масштабе производства (порядка 1 мКи). При промышленном синтезе ( у-32)АТР, использующем 100 мКи PI хлоропласты с феррицианидом практически не работают.

Целью изобретения является повышение выхода ( у-32рз)Р)АТР.

Цель достигается тем, что в способе получения ( y- PjATP, с использованием хло- ропластов растений за счет энергии света, в качестве кофактора реакции фосфорилировэ- ния применяют феназинметасульфат или его производные,

Работу фотосистемы 2 в ЭТЦ хлоропла- стов можно шунтировать, если использовать в качестве кофактора феназмнмегасульфат, выполняющий одновременно функцию донора п акцептора электронов фотосистемы 1, Аппарат фотосистемы 1 существенно более стабилен, чем аппарат фотосистемы 2.

Экспериментально обнаружено, что использование в качестве кофактора реакции

феназинметасульфата позволило увеличить пыход ((33) до 90% и более от уровня исходного PI. Очень важно, что такой выход продукта можно получить при использовании 100 мКи 32Р,, т.е. в условиях промышлениого производства.

Пример 1, Использование в качестве кофактора реакции феназинметасульфата.

Хлоропласты выделяют из листьео гороха по ранее описанному методу. В выделенные хлоропласты добавляют глицерин до 10%, замораживают и хранят в жидком азоте. 100 мКи Рз32РО в 100 мкл 0.04 М HCI упаривают на ротационном испарителе для удаления соляной кислоты и растворяют в

50 мкл дистиллированной воды. Реакционная смесь (общий объем 100 мкл) содержала 40 мМ трицин-ПаОН, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 10 мМ KCI, 50 мкМ феназинметасульфат, 5 мМ АДР хлороппасты (30 мкГ хлорофилла).

Реакционную смесь освещают лампой накаливания при освещенности 50000-100000 Люкс в течение 10 мин. Выход реакции составляет 90-95% от исходной Нз32РО(. Реакционную смесь центрифугируют 5 мин

при 8000 хд. Полученный таким образом (у-3 Р)АТР выделяют с использованием высокоэффективной хроматографии на хрома-, тографе фирмы 1KB (Швеция).

Пример 2. Использование в качестве

кофактора реакции 1-метэкси-5-метилфена- зинметасульфата. Процедуру получения и выделения целевого продукта осуществляют, как описано а примере 1 за исключением того, что вместо феназинметасульфата

используют 5-метилфеназинметасульфат в концентрации 50 мкМ. Выход ( у-32Р)АТР составлял 90-95%,

Пример 3. Использование в качестве кофактора реакции пиоцизнин. Процедуру

получения и выделения целевого продукта осуществляют, как описано в примере 1 за исключением того, что вместо феназинметасульфата используют пиоцианин в концентрации 50 мкМ. Выход ( y-j2P)ATP составлял

90-95%.

Пример 4, Получение ( у-33Р)АТР. Процедуру получения осуществляют как описано в примере 1, за исключением того, что вместо 100 мКи Нз32РО брали 30 мКи

-32(33)Р)АТР до

Нз33Р04 Выход (у -33Р)АТР составляет 90- 95%.

Использование описываемого способа обеспечивает по сравнению с известными ряд преимуществ.

увеличение выхода ( у- 90% и выше,

обеспечение высокого выхода для получения больших порций радиоактивного продукта, т.е возможность использования в промышленных условиях,

а также упрощение синтеза,

сокращение времени синтеза до 2-10 мин при обеспечении при этом высокого выхода.

Способ опробован для получения ( у -32(33ф)АТР в условиях промышленного производства при загрузках до 100 мКи радиоактивного сырья Выход

целевого соединения составляет более 90%.

По сравнению с ранее используемой ферментативной технологией получения (у -32 33 р)АТР, предложенный способ позволяет сократить время синтеза с 40-60 до 2-10 мин.

Формула изобретения Способ получения аденозин-б -трифосфата,меченного изотопами фосфора в положении фосфорилированием аденозин-5 -дифосфата хлоропластами хлоропластов растений за счет энергии света и кофактора реакции фосфори- лирования, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве кофактора реакции фосфорилирования применяют фена- зинметасульфат или его производные.

Использование: в качестве радиоактивной метки в биохимических и молеку- лярно-бнологических исследованиях. Сущность изобретения: продукт здено- зин-5 -( у-32/33Р)-трифосфат, выход 90%- 95%. Реагент 1: хлоропласты растений (гороха), реагент 2: Фетэзннметасульфат или 1-метокси-5-метилфеназинмегасуль- фат, или пиоцианмн.Условия реакции: при облучении УФ в присутствии Н 32/33 Р04. О 1-