Штамм бактерий РSеUDомоNаS SYRINGae - деструктор оксипропилированного этилендиамина Советский патент 1992 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, ко- торый может -быть использован для локальной очистки сточных вод химических предприятий, синтезирующих лапрамолы - азотсодержащие полиспирты, применяемые в производстве жестких пенополиуретанов.

. -i

Сточные воды, образующиеся при получении азотсодержащих полиспиртов, проходят стадию концентрирования на специальных мембранных фильтpax и затем подвергаются термическому обезвреживанию. Для сжигания концентрата сточных вод расходуется природный газ или мазут. Сжигание сопровождается загрязнением атмосферы продуктами неполного сгорания и распространением их в окружающей сре- де- ..-. .-.. ;

Перспективным является микробиологический способ очистки стоков, основанный на применении культур микроорганизмов (бактерий), способных использовать полиспирты в качестве единственного источника углерода и энергии с полной минерализацией субстрата. До настоящего времени не удалось обнаружить сведений о штаммах микроорганизмов, способных утилизировать азотсодержащие полиспирты, в частности оксипропилированный этилендм- амии (ОПЭДА) - Лапрамол 294.

Целью изобретений является новый штамм бактерий - активный Деструктор ок- сипропилированного этйлёндиамина с условной молекулярной массой 294, способный к полному разложению этого соединения. Использование предлагаемого штамма в очистке стоков экономически боVJ

00

СЛ Ч)

лее выгодно и не приводит к загрязнению окружающей среды.

Штамм Pseudomonas syringae ВКМ В- 1744 Д получен методом накопительных культур, где в качестве источника углерода и энергии использовали ОПЭДА. В условиях реального производства Лапрамола 294 брали пробы пыли, на которую попадало вещество, с поверхности химических реак- тор бв и другого технологического оборудо- ванияггары, пола, а также образцы сточных вод - места возможной естественной адаптации и размножения микроорганизмов-деструкторов ОПЭДА Образцы пыли и стоков суспендировали в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2), а затем вносили (по 25 мл) в колбы (500 мл), содержащие 150 мл питательной среды следующего состава, г/л: Na2HP04 12 Н20 1,5; КН2РО г2Н20 1,0; Nf-ЦМОз 0,2; NaCI 0,1; ОПЭДА 0,5; вода водопроводная до 1 л, рН 7,2-7,4. Культивирование проводили на качалке (180 об/мин), температура 28-30°С. Через каждые две недели из колб отбирали пробы и определяли остаточное содержание субстрата с помощью фотометрического метода, модифицированного для определения оксипропи- лированного этилендиамина (2,3). Метод основан на экстракции вещества хлороформом и образовании окрашенного соединения с ионами роданокобальта. По мере утилизации субстрата в колбы добавляли

новые порции ОПЭДА до концентрации 0,5 г/л. После нескольких месяцев культивирования из колб производили рассев микроорганизмов на агаризованную питательную среду (минеральный состав приведен выше

-+15,0 г/л агара). Штамм был представлен наиболее быстрорастущей колонией. В дальнейшем культура подвергалась дополнительной адаптации к ОПЭДА в жидкой среде, содержащей возрастающие количества субстрата (от 0,5 до 3,0 г/л).

Штамм Pseudomonas syringae ВКМ В- 1744 Д идентифицирован по 8-ому изданию Определителя Берги и имеет следующие свойства.

Морфолого-культуральные признаки.

Клетки одиночные, короткие палочки 0,5x1,0 мкм, подвижные (1-3 полярных жгутика); грамотрицательные. Не кислото- устойчивые, Деление клеток происходит в одной плоскости, расходятся клетки беспорядочно. Клеточные включения отсутствуют.

Использование. лбкальна я очидтка сточных вод химических предприятий, синтезирующих лапромолы-аЗ от ббдержащие полиспирты, Сущность: штамм Pseudo- monas syrlngae 10 получен методом накопительных культур, где в качестве источника углерода и энергии использовали рксипро- пилированный этилендиаммн. Штамм. Pseudomonas syringae депонирован под номером ВКМ В-1744, осуществляет полную утилизацию вещества, содержащегося в локальных стоках в концентрации 0,5-3,13 г/л за 4-12 сут. 1 табл.

Рост на плотных средах Мясо-пептонный агар, 30°С, 3 сут

Штрих

обильный, сплошной с розным краем или слегка волнистым краем, вязкой консистенции, кремового цвета

круглые, 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, блестящие , край ровный,структура однородная, цвет обратной стороны колонии идентичен цвету самой колонии-кремовый, пигмент в среду не выделяют, вязкие

Биомасса клеток имеет специфическтй запах. Сусло-агар, 30°С, 3 сут

Штрих

умеренный, сплошной, переходящий в четковид- ный с зубчатым краем, бесцветный, вязкой консистенции

Биомасса клеток имеет слабый запах при комнатной температуре. Минеральная агармзованная среда с 3 г/л,ОПЭДА, 30°С, 7 сут

Штрих

скудный, сплошной, переходящий в цепочку отдельных колоний, бесцветный, вязкой консистенции

Колонии

Т

Колонии

круглые, 2-3 мм, поверхность гладкая, выпуклые, блестящие, край ровный, структура однородная, слизкие, бесцветные, обратная сторона колонии того же цвета, пигмент в среду не выделяют

Колонии

круглые, 1т2 мм, поверхность гладкая, выпук- i i лые, блестящие, край ровный, структура од нородна, слизистые, с возрастом более вязкие, бесцветные, пигмент не выделяют

Биомасса клеток не имеет запаха.

Рост на жидких средах Мясо-пептонный бульон, 30°С, 3 сут, качалка (180 об/мин)

Характер роста

сильн помутнение среды, рыхлое кольцо корич- без изменений невого цвета на стенке колбы, осадка нет

Культуральная жидкость имеет специфический запах. Пивное сусло (6-7°Б), 30°С, 3 сут, качалка (180 об/мин)

Характер роста

слабое помутнение среды, рыхлое кольцо корич- без изменений невого цвета на стенке колбы

Минеральная среда с 3,0 г/л ОПЭДА, 10 сут, качалка

Характер роста

умеренное равномерное помутнение среды, скудный подкисление среды с рН 7,2 до 6, рыхлый осадок серого цветаV

Культуральная жидкость запаха не имеет.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб, осуществляет дыхание, анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный. Растет при температуре от +8 до +40°С, оптимальная температура роста 28-30°С Растет в интервале рН 5,0-9,0 Оптимум рН среды для проявления деструктивных свойств 7,0-7,5, Растет в присутствии 7,0% NaCI Поли-/ -оксибутират не накапливает в клетках на средах с соотношением C:N более 10.

Чувствителен к 5 мкг/мл стрептомицина, 40 мкг/мл тетрациклина, рифампицина, налидиксовой кислоты, не чувствителен к 200 мкг/мл амггицилина

Источники углерода

Образует кислоту из D и L-арабинозы, ксилозы, глюкозы, фруктозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, маннита на среде, г/л: пептон - 3,0; КаНРО - 0,6, МаС - 2,5: 2 мл 1,6% спиртового раствора бромтамолового синего. Реакция Фогес-Лроскауэра отрицательная.

Ассимилирует органические кислоты лимонную, янтарную, пропиновокислую малоновую, адапиновую уксусную, щавелевую, муравьиную, малеиновую, аскорбиновую на среде, г/л: (NH/ib HPOo 0.5 MgS04 7Н20 0,2; NaCI 0,1; агар-агар 15,0, органическая кислота 2.0: 20 мл 0,04% водного раствора фенолового красного, рН 6,8.

Утилизирует: глицерин, лактозу, пропи- ленгликоль, L-аргинин L-валин, L-аланин, L-сорбит.

Источники азота

Изменение среды

Изменение среды

Изменение среды

Растет с солями аммония- пептоном,

0 (, NH-qNOa, NI-MCI; с нитратами- KNOs NaNOa; NaN02 на среде, г/л. глюкоза 20 О К2НР04, КН2Р04 2,0, KCI 0,5; MgSO 7Н20 0,5; агар-агар 15,0, соединения азота 100 1 мл раствора микроэлементов

5 Разлагает казеин, не гидролизует крахмал и тирозин, разжижает желатину. Образует аммиак, не образует индол и сероводород.

Штамм обладает каталазной, уреазной

0 и нитратредуктазной активностью Восстанавливает нитраты до нитритов на среде МПБ + 0,2 % KNOs He обладает оксидазной, аргининдегидролазной, лецитиназной активностью

5Для роста и деструкции оксипропилированного этилендиамина не требует активаторов и стимуляторов. Деструктивные свойства сохраняет при хранении на минеральной агаризованной среде при 2-4°С в

0 течение 6 месяцев, лиофильно высушенным в ампулах (криопротектор - 10 %-ная сахароза -г 1 %-ный желатин) в течение 1 года Штамм не токсичен и не патогенен

П р и м е р 1 Посевной материал выра5 щивали на качалке (180 об/мин) в течение 5-6 сут при 30°С на среде следующего состава, г/л NH4N03 1,0, NaH2P04 1 О К2НР04 4,0, MgSO/i 7Н20 0,2 NaCI 0,2 микроэлементы- 1 мл концентрата, ОПЭДА 1,0, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,2- 7,3

Выращенным посевным материалом инокулируют (посевная доза 109 кл/мл) колбы объемом 1000 мл содержащие 150 мл

питательной среды (элементный состав приведен выше) Количество ОПЭДА в среде 0,5 г/л. Культивирование проводят при 30°С на качалке (180 об/мин). О способности штамма разрушать ОПЭДА судят по уменьшению концентрации вещества в среде с помощью фотометрического метода.

После 72 ч инкубации концентрация ОПЭДА снизилась на 63,8 процента.

П р и м е р 2 Условия аналогичны описанным в примере 1 за исключением того, что в колбы вносят 150 мл реальной сточной воды цеха по производству ОПЭДА, содержащей 1,0 г/л вещества. Добавляют биоген- ные элементы (соли) из расчета, г/л: ГМНйМОз 1,0; NaCI 0,1; NaH2P04 1,0; К2НР04 4,0; MgS04 7Н20 0,1.

После 120 ч инкубации штаммом разрушено 79,0% ОПЭДА.

0

5

В таблице приведены результаты деструкции вещества в динамике в зависимости от концентрации оксипропилирован- ного этилеидиамина в сточной воде.

Штамм Pseudomonas syringae ВКМ В- 1744 Д осуществляет полную утилизацию оксипропилированного этилендиамина в концентрации 0,5-3,0 г/л за 4-12 суток.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Pseudomonas syringae ВКМ В-1744 Д возможна эффективная очистка сточных вод от оксипропилированного этилендиамина - Лапрамол 294.

Формула изобретения Штамм бактерий Pseudomonas syringae ВКМ В-1744 Д - деструктор оксипропилированного этилендиамина.