Способ получения функционально активных мембранных рецепторных белков Советский патент 1992 года по МПК C12P21/06 

Изобретение относится к молекулярной биологии и структурно-функциональным исследованиям мембранных рецепторных белков, а именно, к разработке нового способа получения функционально активных мембранных рецепторных белков, основанного на трансляции in vitro соответствующих мРНК в присутствии искусственных липосом и приводящего к получению встроенных в мембрану функционально активных рецепторных белков (т.е. их функциональной экспрессии).

Особый интерес с точки зрения фундаментальной биологии и прикладного использования полученной информации в медицине представляет изучение эукарио- тических мембранных рецепторов различных белковых факторов, гормонов,

нейромедиаторов. Детальное изучение молекулярных механизмов функционирования подобных рецепторов практически невозможно без клонирования их генов, их функциональной экспрессии в какой-либо гетерологичной системе и белково-инже- нерных исследований.

Известен традиционный способ, используемый для функциональной экспрессии рецепторных мембранных белков - экспрессия в культивируемых линиях клеток млекопитающих или экспрессия в ооцитах африканской лягушки Xenopus laevis.

К недостаткам этого способа относится его экспериментальная сложность, трудоемкость, дороговизна используемого специ- ального оборудования и реагентов (особенно в случае культивируемых линий

V

|ГО CJ

ю о

клеток) и низкий уровень синтеза белка (особенно в случае ооцитов X. laevis). Известно использование систем синтеза белка in vitro (экстракта из зародышей пшеницы, ли- зата ретикулоцитов кролика и др.) для экс- прессии гетерологичных мембранных рецепторных белков путем их контрасляци- онной встройки в препараты экзогенных микросомных мембран,

Однако, необходимость использования сравнительно труднодоступных препаратов микросомных мембран из природных источников, а также необходимость очистки синтезированного рецептора от примесных белков природных мембран является недо- статком и препятствует применению систем трансляции in vitro со встраиванием белка в микросомные мембраны как альтернативы культурам клеток млекопитающих и ооцитам X. laevis.

Целью изобретения является упрощение способа.

Такое упрощение способа вызвано тем, что получение и использование искусственных липосом является более простым, чем получение и использование природных мик- росомальных мембран, применяемых в прототипе изобретения.

Кроме того, дополнительными преимуществами являются: возможность упрощенного выделения и очистки синтезированного м котрансляционно встроенного в липосомы рецелторного белка после окончания процесса трансляции in vitro путем отделения липосом центрифугировани- ем в ступенчатом градиенте плотности либо другим известным методом отделения липосом от раствора; возможность котрансляци- онной встройки синтезируемого белка в липосомы, имеющие различный липидный состав, расширяя таким образом экспериментальные возможности исследователя; отсутствие эндогенных мембранных рецепторов функциональная активность которых может интерферировать с активностью исс- ледуемого рецептора, в искусственных ли- посомных мембранах в отличие от природных микросомных.

В систему для трансляции in vitro мРНК рецепторного мембранного белка вводят в качестве мембран искусственные липосомы для обеспечения котрансляционной встройки в липосомную мембрану синтезируемого белка.

Для описания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления. В качестве типичного эука- риотического мембранного рецепторного белка в примерах использован зрительный родопсин быка, обладающий структурным и

функциональным сходством со многими эукариотическими рецепторами белковых гормонов и нейромедиаторов.

Пример 1. Транскрипция in vitro кДНК родопсина быка. Матричная РНК, необходимая для экспрессии белков в предложенной системе, может быть как выделена из природных источников, так и синтезирована in vitro. Транскрипцию in vitro кДНК зрительного родопсина быка осуществляют следующим образом.

Линеаризованную ДНК плазмиды pG2S6-1 (50 мкг/мл), полученную путем клонирования кДНК опсина быка в вектор pGEM2 под контроль промотора SP6, добавляют к раствору 40 мМ трис-HCI, рН 7,5, 16 мМ MgCIa, 2 мМ спермидина, 40 мМ ДТТ, 1 ед/мкл ингибитора РНКаз из плаценты человека и 2,5 мМ каждого из 4 рибонуклео- зидтрифосфатов и РНК-полимеразы фага SP6 в концентрации 1 ед/мкл, инкубируют при 37°С 4 ч. Затем смесь последовательно экстрагируют равным объемом фенола, фенола-хлороформа (1:1) и хлороформа, мРНК очищают селективным осаждением 2,5 М LiCI при 0°С 40 мин. Суспензию центрифугируют 20 мин при 10000 хд, осадок-раство- ряют в воде и 2 раза переосаждают 75% этиловым спиртом в присутствии 300 мМ ацетата натрия. Транскрипцию ведут в объемах от 50 мкл до 5 мл,

П р и м е р 2. Получение липосом из фосфатидилхолина.

Для получения липосом из фосфатидилхолина фосфатидилхолин из соевых бобов (200 мг) растворяют в 1 мл хлороформа, переносят в широкую стеклянную пробирку, и упаривают хлороформ током азота таким образом, чтобы липид образовал тонкую пленку на поверхности стекла. В пробирку добавляют 4 мл 10 мМ раствора ДТТ, охлаждают до 0°С и диспергируют ультразвуком 5 раз по 1 мин с перерывами 1 мин при постоянном охлаждении. Липосомы разделяют на аликвоты и хранят при (-70)°С.

П р и м е р 3. Трансляция in vitro опси- новый мРНКс котрансляционной встройкой синтезируемого опсина в липосомы

Трансляцию in vitro синтетической мРНК родопсина быка с котрансляционной встройкой синтезированного опсина в липосомы ведут в экстракте из зародышей пшеницы (50% объема трансляционной смеси) в присутствии 50 мМ ацетата калия, рН 7,5, 2 мМ ацетата магния, 3 мМ дитиотреитола, 0,08 мМ спермина, 1,2 мМ АТФ, 0,08 мМ ГТФ, 30 мМ креатинфосфата, 0,7 мг/мл кре- атинфосфокиназы, 250 ед. активности в 1 мл ингибитора РНКаз из плаценты человека, 50

мкМ каждой из 19 аминокислот и 50 мкМ (14С) лейцина.

В трансляционную смесь добавляют матричную олеиновую РНК до конечной концентрации 200 мкг/мл и липосомы из фосфатидилхолина до конечной концентрации 2,5 мг/мл липида, Трансляцию ведут в течение 120 мин при 23°С. Уровень синтеза белка определяют по включению радиоактивности в кислотонерастворимую фракцию и вычисляют исходя из содержания лейцина в данном белке. Для этого аликвоту (5 мкл) трансляционной смеси наносят на бумагу Ватман ЗМ (1 х 1 см), которую выдерживают в холодной 10%-ной ТХУ 20 мин, а затем в кипящей 5%-ной ТХУ 10 мин. Фильтры затем промывают последовательно этиловым спиртом и диэтиловым эфиром, сушат и просчитывают в 5 мл сцинтиллятора Брея (на 1 л диоксана 80 г нафталина, 4 г дифенилоксазола и 0,2 г ПОПОП) в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Уровень синтеза родопсина в описанных условиях составляет 40 мкг белка на 1 мл трансляционной смеси.

П р и м е р 4. Выделение липосом со встроенным опсином из трансляционной смеси, регенерация родопсина, тестирование его функциональной активности.

Липосомы, содержащие котрансляци- онно встроенный рекомбинантный родопсин, выделяют из трансляционной смеси следующим образом.

Трансляционную смесь разбавляют в 2 раза на холоду 20 мМ ЭДТА и инкубируют 10 мин, затем наслаивают на буфер, содержащий 30 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 150 мМ ацетата калия, 5 мМ ДТТ и 0,2 М сахарозы и центрифугируют при 2 С 2 ч при 100000 х д. Осадок суспендируют в том же буфере без сахарозы, центрифугируют в тех же условиях 60 мин и хранят при (-70)°С. Содержание рекомбинантного родопсина в мембранных фракциях определяют так же, как его содержание в трансляционной смеси, В описанных условиях количество интегрированного в липосомы родопсина составляет 20% от всего синтезированного родопсина.

Для подтверждения того, что белок действительно интегрировался в соответствующие мембраны, применяют следующий метод.

Мембранную фракцию суспендируют в 0,1 М NaaCOa, рН 11,0, наслаивают на такой же буфер с 0,2 М сахарозы и центрифугируют при 2°С 2 ч при 100000 х д.

Затем осадок суспендируют в том же буфере без сахарозы и осаждают центрифугированием в тех же условиях 60 мин. Полученный осадок суспендируют в буфере с

рН 7,5 и определяют содержание в нем рекомбинантного родопсина. Содержание родопсина в липосомах, подвергшихся отмывке при рН 11,0, уменьшается не более

чем на 15% по сравнению с липосомами, не подвергавшимися такой отмывке.

Регенерацию встроенного в липосомы опсина 11-цис-ретиналем проводят 30 мин при 4°С в присутствии 100-кратного моляр0 ного избытка 11-цис-ретиналя. При этом рекомбинантный родопсин приобретает характерный спектр с максимумом поглощения 500 нм, близкий к спектру природного родопсина.

5 Реконструкцию -зрительного каскада проводят в буфере, содержащем 40 мМ HEPES-KOH, рН 7,8, 150 мМ NaCI, 6 мМ MgSCM, 3 мМ дитиотреитола. К исследуемому препарату рекомбинантного родопсина

0 добавляют 10 мкг транслуцина мкг ФДЭ из сетчатки быка, и инкубируют 20 мин при 0°С в присутствии или в отсутствие 10 мкМ нег идролизуемого аналога GTP 5 -гуанозин- $, } имидо)трифосфата. Активность ФДЭ

5 определяют по методу Страйера в 150 мкл того же буфера при 0°С 5 мин при концентрации цГМФ 1 мМ (250000 имп/мин (ЗН)цГМФ). Реакцию останавливают кипячением в течение 2 мин, добавляют 0,1 ед.

0 активности фосфатазы из внутренностей теленка и ZnCte до конечной концентрации 2 мМ, инкубируют 15 мин при 30°С и наносят на колонки 0,7 х 2 см с ДЭАЭ-Сефадексом. Продукт элюируют непосредственно во фла5 коны для сцинтилляционного счета и просчитывают в 10 мл сцинтиллятора Брея в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Способность котрансляционно встроенного в липосомы зрительного родопсина активи0 ровать фосфодиэстеразу цГМФ зрительного каскада усиления не отличается от таковой природного родопсина из сетчатки быка.

Таким образом, изобретение (способ получения мембранных рецепторных

5 белков в функционально активном виде, основанный на липосомосопряженной трансляции in vitro их мРНК) позволяет достичь высокого уровня синтеза функционально активного зрительного родопсина

0 быка в системе трансляции in vitro из зародышей пшеницы с котрансляционным добавлением искусственных липосом. Структурное и функциональное сходство родопсина со многими другими мембранны5 ми рецепторными белками позволяет предложить данную систему функциональной экспрессии для других белков этой группы. Формула изобретения Способ получения функционально активных мембранных рецепторных белков,

включающий трансляцию in vitro мРНКмем- чающийся тем, что, с целью упрощения бранного рецепторного белка и его котран- способа, в качестве мембраны используют сляционное встраивание в мембрану, от л и- искусственные липосомы.

Изобретение относится к молекулярной биологии и структурно-функциональным исследованиям мембранных рецепторных белков, конкретно к разработке нового способа получения функционально активных мембранных рецепторных белков, основанного на трансляции in vitro соответствующих мРНК в присутствии искусственных липосом и приводящего к получению встроенных в мембрану, функционально активных рецепторных белков (т.е. их функциональной экспрессии). Целью изобретения является упрощение способа. Создан новый способ получения функционально активных мембранных рецепторных белков путем трансляции in vitro мРНК мембранного рецепторного белка и его котрансляцион- ного встраивания в искусственные липосомы. со с