Способ получения иммобилизованного коммерческого пепсина Советский патент 1992 года по МПК C12N11/14 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для промышленного получения препаратов иммобилизованного пепсина.

Известны способы двухэтапной иммобилизации ферментов на гидроксидах переходных металлов, где в качестве носителя . используют гидроксид металла, который получают при гидролизе соответствующего хлорида.

Недостатком этих способов является то, что в этих случаях иммобилизация фермента . происходит преимущественно за счет ад сорбции и не обеспечивается необходимая прочность связи с носителем как фермента, так и содержащегося в коммерческом пепсине группоспецифического фактора крови А + Н (ГСФ) Такой иммобилизат не обеспечивает деконтаминации ферментируемого целевого продукта от группоспецифического фактора.

Цель изобретения - получение чистого целевого продукта за счет одноэтапного формирования прочного халатного комплекса гидроксида титана с иммобилизованным на нем пепсином и группоспеци- фичёским фактором крови А + Н. который

не сползает с носителя при дальнейшем ферментолизе целевого продукта (антитоксических сывороток) и не загрязняет их.

Поставленная цель достигается тем, что к буферному раствору пепсина с концентрацией пепсина 8 мг/мл добавляют раствор соли четырехвалентного титана, образовав- шийся осадок с иммобилизованным пепсином и группоспёцифическим фактором крови А + Н отделяют и промывают буферным раствором, причем пепсин используют в 0,2 М ацетатном буферном растворе с рН 3,9-4,5 и добавляют раствор четыреххлористого титана из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина.

П р и м е р 1. К 1000 мл 0.2 М ацетатного буферного раствора (рН 4,15), содержащего препарат пепсина в концентрации 8 мг/мл, добавляют при постоянном перемешивании 100мл 0,125 М кислого раствора четыреххлористого титана (на 1 мг препарата пепсина добавляют 1,56 мкмоль четыреххлористого титана). Оставляют при периодическом перемешивании на 4 ч, а затем без перемешивания - на 16 ч при комнатной температуре. Образовавшийся осадок с иммобилизованными пепсином и группоспеVIСА) О

м

4 00

цифическим фактором отделяют фильтрацией и промывают на фильтре 0,2 М ацетатным буферным раствором с рН 4,15. Выход целевого продукта 32% от исходного веса пепсина. Присутствие в готовом препарате (антитоксической сыворотке) примеси ГСФ А + Н выявляют с помощью реакции торможения гемагглютинации - ОТГА. Агглютинации в РТГА наблюдают во всех лунках, начиная с первой.

П р и м е р 2. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что используют ацетатный буферный раствор с рН 3,9, Выход целевого продукта 30%. Результаты реакции торможения гемагглютинации, та- кие же как в примере 1.

П р и м е р 3. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что используют ацетатный буферный раствор с рН 4,5. Выход целевого продукта 31 %. Результаты реакции торможения геммаглютинации, такие же как в примере 1.

П р и м е р 4, Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что к раствору пепсина добавляют 0,064 М раствор четыреххлористого титана, т.е. на 1мг препарата пепсина добавляют 0,8 мкмоль этой соли. Выход целевого продукта 31%. Результаты реакции торможения гемагглютинации такие же, как в примере 1,

При м°е р 5. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что добавляют 0,200 М раствор четыреххлористого титана, т.е. на 1 мг препарата пепсина добавляют 2,5 мкмоль этой соли. Выход целе- вого продукта 30%. Реакция торможения гемагглютинации показывает отсутствие группоспецифического фактора.

П р и м е р 6. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что исполь- зуют ацетатный буферный раствор с рН 3,5, Выход целевого продукта 24%. Результаты РТГА показывают отсутствие ГСФ.

Пример. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что исполь- зуют ацетатный буферный раствор с рН 5,0. Выход целевого продукта 26%. Результаты РТГА показывают отсутствие ГСФ.

Пример 8. Выполняется аналогично примеру 1, за. исключением того, что добавляют 0.300 М раствор четыреххлористого титана, т.е. на 1 мг препарата пепсина добавляют 3,75 мкмоль этой соли. Выход целевого продукта 26%. Результаты реакции РТГА показывают отсутствие ГСФ.

Л р и м е р 9. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что добавляют 0.030 М раствор четыреххлористого титана, т.е. на 1 мг препарата пепсина добавляют 0,375 мкмоль этой соли. Выход целевого продукта 30%. В реакции РТГА выявлен ГСФ.

Результаты проведенных опытов представлены в таблице.

Из результатов, приведенных в таблице, следует, что предлагаемый способ позволяет получать иммобилизованный пепсин, не вызывающий при его использовании в ферментолизе антитоксических сывороток, контаминации этих сывороток группоспецифическим фактором А + Н.

Предлагаемые диапазоны параметров выполнения способа являются оптимальными. Выход за эти параметры приводит или к уменьшению выхода целевого продукта (при отклонениях рН и повышении количеств четыреххлористого титана), или к появлению в конечном продукте - очищенной концентрированной антитоксической сыворотке - примесей группоспецифического фактора крови А + Н.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного коммерческого пепсина, предусматривающий осаждение пепсина из буферного раствора раствором четыреххлористого титана с последующим отделением и промыванием осадка этим же буфером, о тличающий- с я тем, что, с целью повышения активности и чистоты целевого продукта за счет связывания группоспецифического фактора крови А + Н. растворение коммерческого пепсина ведут в ацетатном буфере с рН 3,9- 4,5, а раствор четыреххлористого титана добавляют из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина.

Использование: фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: пепсин осаждают из ацетатного буфера с рН 3,9-4,5 раствором четыреххлористого титана из расчета 0,8-2,5 мкмоль на 1 мг препарата пепсина. 1 табл.