Способ определения антителозависимой цитотоксичности лимфоцитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для характеристики функционального состояния имунной системы.

Цель изобретения.- упрощение и повышение достоверности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

10 мл крови, полученной путем пункции вены, смешивают с гепарином (20 ед/мл), для осаждения эритроцитов добавляют 1 мл 10%-ной желатины и помещают в термостат при 37°С на 30 мин.. Плазму, обогащенную лейкоцитами, наслаивают на градиент фи- колла-верографина плотностью 1,077 и центрифугируют 45 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования взвесь мононук- леарных клеток, извлеченных из интерфазы, отмывают дважды холодной средой 199. Промытые мононуклеарные клетки затем суспендируют полной питательной средой, состоящей из среды 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 1-тлютамина (300 мг/мл) и гентамицина (0.08 мг/мл).. Клетки разводят до концентрации 8x106 на мл.. ..;

В качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты. Взвесь аутозритроцитов дважды промывают физиологическим раствором, после этого аутоэритроциты обрабатывают папаинрм в течение 10 мин. Промывают один раз физиологическим раствором от папаина. После этого эритроциты разделяют на две пробирки Аи Б. Пробирку А с аутоэритроцитами инкубируют гипериммунной антиэритроцитарной антисывороткой кролика в течение 10 мин. После инкубации эритроциты промывают дважды средой 199 и суспендируют до концентрации 8 х105 на мл, чтобы соотношение эффекторов и клеток-мишеней было 10:1.

Цитотоксический тест определяют в пластиковых 96-луночных планшетах (Ленинград, завод Медполймер). В опытные лунки в триплете добавляют по 0,1 мл ауто- эритроцитов, нагруженных антителами, и

сл

с

sj

0

0,1 мл эффекторных клеток в соответствующих концентрациях, контроль ставят в двух вариантах. Один из них - для спонтанного лизиса, где в лунке 0,1 мл аутоэритроцитов, необработанных антисывороткой, и 0,1 мл зффекторные клетки. Другой для определения общего лизиса клеток-мишеней лунки содержит 0,1 мл аутоэритроцитов и 0,1 мл полной питательной среды. Планшеты инкубируют при 37°С, 18 ч во влажной атмосфере воздуха с 5% СОа. По истечении этого времени содержимое лунок отсасывают в центрифужные пробирки и разводят 2 мл физиологического раствора, а второй контроль разводят 2 мл дистиллированной воды для определения общего лизиса клеток-мишеней. После этого центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. 1 мл надосадка отсасывают во флаконы для определения концентрации калия. Степень лизиса клеток-мишеней .регистрируют по выходу калия из разрушенных аутоэритроцитов. Для определения концентрации калия в надосадке применяют пламенный фотометр ПАЖ-2. Индекс ци- тотоксичности (ИЦ) вычисляют по формуле

х 100%

где А - показания фотометра по содержанию калия в опытной пробе;

В - показания фотометра по содержанию калия в первом контроле (спонтанный лизис клеток-мишеней);

С - показания фотометра по содержанию калия во втором контроле (общий лизис клеток-мишеней).

Пример 1. Больной П., 3.4 года. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого.

Из вены путем пункции в пробирку с гепарином взяли 10 мл крови, добавили 1 мл 10%-ной желатины. Кровь помещали в термостат при 37°С на 30 мин. Плазму с лейкоцитами отсасывали и помещали-в 2 мл раствора фиколла-верографина плотностью 1,077. Центрифугировали плазму 45 мин при 1500 об/мин, после чего отсасывали интерфазу. Клетки отмывали 2 раза средой 199 и -взвесь клеток помещали в полную питательную среду в концентрации 8x10 на мл.

Аутозритроциты отмывали дважды физиологическим растгаором хлористого натрия и обрабатывали папаином в течение 10 мин. Отмывали один раз от папаина и разделили на две пробирки. Аутоэритроциты первой пробирки инкубировали с гипериммунной антиэритроцитарной антисывороткой кролика. После инкубации аутоэритроциты промывали дважды средой

199 и суспендировали до концентрации 8 хЮ на мл.

В опытные лунки в триплете смешивали 0,1 мл аутозритроцитов, насаженных антителами, и 0,1 мл эффекторных клеток в соответствующих концентрациях, контроль ставили в двух вариантах, один из них для спонтанного лизиса, где 0,1 мл аутоэритроцитов, необработанных антителами, и 0,1 мл

эффекторных клеток, другой для общего лизиса аутоэритроцитов, где в лунке 0,1 мл аутоэритроцитов и 0,1 мл полной питательной среды. Планшет помещали во влажную камеру с 5% СОа на 18 ч при 37°С. Затем из

каждой лунки отсасывали содержимое в центрифужные пробирки и разводили 2 мл физиологического раствора, а второй контроль разводили 2 мл дистиллированной воды. Затем центрифугировали 5 мин при 1500

об/мин. 1 мл надосадка отсасывали во флаконы и определяли содержание калия на пламенном фотометре ПАЖ-2.

Результаты определения; опытная про- ба 69, первая контрольная проба (спонтанный лизис) 57, вторая контрольная проба (общий лизис) 79.

|Л69-57

Индекс цитотоксичности x

х100% 54,5%.

Это свидетельствует о снижении антитело- зависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов данного больного.

Пример 2. Больной А., 43 года. Диагноз: Сепсис.

Результаты определения. Опытная проба 65, первая контрольная проба (спонтанный лизис) 57, вторая контрольная проба

(общий лизис) 79.

Индекс цитотоксичности х

х100% 36,6% .

Полученные данные также указывают о

снижении антителозависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов у больного.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет упростить определение антителозависимой цитотоксичности по сравнению с прототипом, не снижая ее чувствительности и специфичности. При этом отпадает необходимость в обработке клеток мишеней радиактивным изотопом (Сг51) .дорогостоящего оборудования (у-счетчиков) и специального помещения для защиты от у-облучения. Способ может применяться практически в любой клинической лаборатории для оценки функциональной активности иммунной системы.

517251256

Ф ормул а изобретенияклеток-мишеней, о т ли ч а ю щ и и с я тем,

что, с целью упрощения и повышения достоСпособ определения антителозавИси-верности способа, в качестве клеток-мишемой цйтотоксичности лимфоцитов путемней используют аутоэритро.циты, а

инкубирования лимфоцитов с клетками-5 регистрацию разрушения клеток-мишеней

мишенями, нагруженными антителами, сосуществляютфотометрированием по выхопоследующей регистрацией разрушенияду ионов калия.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы. С цельюупрощения способа в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты, а регистрация их разрушения проводится : по выходу калия из разрушенных клеток-мишеней с помощью фотометрирования.