Способ проведения твердофазного иммуноферментного анализа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к иммунохимии, а именно к способам проведения иммуноферментного анализа антигенов и антител, и может быть использовано для диагностических исследований в инфекционной пато- логии, в технологии изготовления вакцинных препаратов, а также для определения антигенов и антител.

Известны способы определения антигенов и антител к ним в иммуноферментном анализе (ИФА), позволяющие определять 1- 10 нанограмм вирусспецифического белка. Время анализа определяется схемой постановки реакции. При анализе антигенов в сандвич -варианте ИФА на первом этапе компоненты реакции инкубируют при 4°С, а на втором - при 37°С. На весь анализ требуется 16-24 ч.

Известен также способ постановки иммуноферментного анализа, в котором реакцию с испытуемыми антителами на первом этапе инкубируют при 33°С в течение 1 ч, а на втором этапе - с антивидовым коньюгатом втечение 1 ночи при 16-18°С.

Несмотря на чувствительность этих методов и использование универсального коньюгата, который может быть применен для анализа различных антигенов, длительность проведения анализа снижает их ценность.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ проведения твердофазного ИФА, включающий сорбцию соответствующего разведения антигенов (антител) на твердую фазу в объеме ,2 мл на лунку в течение 1-3 ч при 37°С или 1 ночи при 4°С; отмывку лунок (с целью удаления не сорбированных на носителе антигенов или антител) три раза по 5 мин при комнатной температуре; внесение исследуемого материала в лунки, инкубацию в течение 1-3 ч лри37°Сили 18чпри4°С; отмывку непрореагировавших в иммунной реакции антигенов или антител три раза по 5 мин при комнатной температуре; внесение конъюги- рованных антител против исследуемого антигена или антител, инкубацию в течение 2 ч при 37°С; отмывку несвязанного коньюгаif-

|Чета

J

сл

та три раза по 10 мин; внесение субстрата фермента и учет результатов по изменению цвета субстрата или экстинции.

Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме,что определяет длительность анализа, которая согласно известному способу составляет 6- 10ч.

Существенным недостатком данного способа является длительность анализа,

Цель изобретения -ускорение проведения анализа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу проведения твердофазного иммуноферментного анализа, включающему сенсибилизацию лунок панелей вирусспеци- фическими антителами, последовательное их инкубирование с испытуемым интигеном и конъюгатом антител с ферментом, отмывку несвязавшихся компонентов реакции на каждом этапе ее постановки каждый этап реакции взаимодействия антигена с антителом п роводят при 48-53°С в течение 5-10 мин при аостоянном перемешивании реакционной смеси.

П р и м е р 1. На поверхности лунок полистирольного микропланшета адсорбируют вирусспецифические антитела из расчета 0,1 мл на 1 лунку (10 мкг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере с рН 9,4-9,6 в течение 1 ч при .

Затем растворы выливают и лунки промывают три раза по 2 мин физиологическим раствором с рН 7,1-7,2, содержащим поверхностно-активные вещества (0,85% NaCI, 0,05% ПАВ).

В лунки предварительно прогретых панелей с адсорбированными на них антителами вносят по 0,1 мл разведения антигена вируса ящура типа 0 и инкубируют при 48°С при постоянном перемешивании реакционной смеси на шуттель-аппарате в течение 10 мин. После этого растворы выливают, лунки панелей промываюттри раза по 2 мин физиологическим раствором.

В отмытые лунки вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата специфических антител с ферментом и инкубируют в течение 10 мин на шуттель-аппарате при 48°С.

После отмывки в лунки панелей вносят субстрат фермента ортофенилендиамина (ОФД) и инкубируют в течение 10 мин при 48°С на шуттель-аппарате.

Регистрацию результатов проводят визуально по изменению цвета или на спектрофотометре при длине волны 405 нм.

П р и м е р 2. На поверхности лунок полистирольного микропланшета адсорбируют вирусспецифические антитела к вирусу ящура типа А, В дальнейшем подготовку, проведение и учет результатов реакции осуществляют по примеру. 1.

Отличия состоят в том, что на стадиях

взаимодействия антигена с антителами при внесении конъюгата специфических антител с ферментом и при внесении субстрата реакцию проводят при 50°С в течение 10 мин. В качестве фермента можно использовать либо пероксидазу, либо В-лактамазу, либо В-Д-галактозидазу г а в качестве субстрата - либо ОФД, либо АБТС, либо 4МУГ, либо йодинол, что на результаты реакции не влияет.

Пример 3. На поверхности лунок

полистирольного микропланшета адсорбируют гамма-глобулины, выделенные из сыворотки овец, иммунизированных вирусом ящура Азия-1. В дальнейшем подготовку,

проведение и учет результатов реакции осуществляют по примеру 1.

Отличия состоят в том, что на стадиях взаимодействия антигена с антителами при внесении конъюгата специфических антител с ферментом и при внесении субстрата реакцию проводят при 53°С в течение 5 мин. В качестве фермента можно использовать либо пероксидазу, либо В-лактамазу; либо В-Д-галактозидазу, а в качестве субстрата либо ОФД, либо АБТС, либо 4МУГ, либо йодинол, что на результаты реакции не влияет.

П р и м е р 4. На поверхности лунок полистирольного микропланшета адсорбируют гамма-глобулины к вирусу болезни Ауески из расчета 1 мкг/лунка в 0,1 М карбонатном буфере с рН 9,4-9,6 в течение 1 ч при 37°С. В дальнейшем подготовку, проведение и учет результатов реакции осуществляют по примеру 1.

Отличия состоят в том, что на стадиях взаимодействия антигена с антителами при внесении конъюгата специфических антител с ферментом и при внесении субстрата

реакцию проводят при 53°С в течение 5 мин. В качестве фермента можно использовать либо пероксидазу, либо В-лактамазу, либо В-Д-галактозидазу, а в качестве субстрата - либо ОФД, либо АБТС, либо 4МУГ, либо

йодинол, что на результаты реакции не влияет.

П р и м е р 5. На поверхности лунок полистирольного микропланшета адсорбируют вирусспецифические антитела к вирусу ящура разных типов А, О, Азия-1 из

расчета 1 мкг/лунка в 0,1М карбонатном

буфере с рН 9,4-9,6 в течение 1 ч при 37°С.

В дальнейшем подготовку и проведение

реакции осуществляют по примеру 1.

Отличия состоят в том, что на стадиях взаимодействия антигена с антителами при внесении конъюгата специфических антител с ферментом и при внесении субстрата реакцию проводят при 53°С в течение 5 мин. В качестве конъюгата используют В-Д-га- лактозидазу, а в качестве субстрата-4-мети- лумбензиферил В-Д-галактопиранозид. Учет результатов проводят на микрофлюориметре Микрофлюор фирмы Дайнатек.

Примерб. Для проведения иммунофер- ментного анализа в полевых условиях в стерилизаторе (или другой посуде) нагревают воду до 53°С. Температуру воды контролируют термометром. В таких условиях предпочтительней реакцию начинать с внесения в сенсибилизированные антителами лунки панелей исследуемого антигена. Это возможно в случаях, когда изготовитель поставляет потребителю наборы, содержащие полистироловые панели, сенсибилизированные антителами.

После внесения антигена панель помещают на 7 мин в стерилизатор (или другую посуду), содержащий подогретую до 53°С воду. Панель плавает по поверхности воды. Через 7 мин лунки панелей три раза промывают промывочным раствором, содержащим поверхностно-активное вещество. В отмытые лунки панели вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата и панель помещают на поверхность подогретой до 53°С воды. Через 7 мин лунки панелей отмывают от несвязавшихся компонентов промывочным раствором. После внесения субстрата фермента реакцию учитывают по изменению цвета субстрата в сравнении с контролем.

Пример. В лунки панели вносят по 0,1 мл кроличьих вирусспецифических антител в концентрации 1 мкг/лунка, разведенных на карбонатно-бикарбонатном буфере с рН 9,4-9,6. Панель помещают в термостат и инкубируют при 37°С 1 ч или при 4°С 18 ч. Затем лунки панелей отмывают промывочным буфером и в них вносят эталонный антиген в концентрации 4 антигенных единицы. Панели помещают в шейкер-инку- батор и инкубируют реакцию при 53°С 7 мин. После этого лунки панелей отмывают промывочным раствором и в них вносят испытуемые и контрольные сыворотки.

Панели выдерживают при 53°С 7 мин. После отмывки в лунки панелей вносят коньюгат вирусспецифических антител с ферментом и выдерживают при 53°С 7 мин. После отмывки в лунки вносят субстрат

фермента. Учет результатов проводят через 2-5 мин после внесения субстрата по изменению цвета жидкости в лунках.

Результаты исследований представлены в табл.1 и 2.

В табл.1 показан выбор оптимальной температуры инкубирования ИФА.

Из данных табл.1 видно, что повышение температуры инкубирования реакции позволяет сократить время на ее проведение. Самый высокий титр антигена получен при инкубировании реакции при 53°С по 10 мин на каждом этапе.

В табл.2 приведены результаты выбора

оптимального времени инкубирования реакции при 53°С.

Полученные в табл.2 результаты свидетельствуют о том, что оптимальное время колеблется в пределах 5-10 мин. При более

продолжительной инкубации происходит потеря чувствительнсоти анализа. Из табл.2 также видно, что использование различных ферментов и субстратов на результаты реакции не влияет.

Предлагаемый способ по сравнению с

известным дает возможность сократить время на проведение анализа пробы в твердофазном ИФА на 5,5-8,5 ч. Это достигается тем, что проведение реакции при 48-53°С

с одновременным постоянным перемешиванием реакционной смеси приводит к достижению равновесного режима в более короткий срок, увеличивает возможность первичного контакта антигена с антителами, в результате ускоряется образование иммунных комплексов и последующее их выявление.

Ускорение анализа очень важно при диагностике инфекционных болезней. Способ

позволяет проводить анализ материалов в любых условиях, в т.ч. полевых.

Формула изобретения Способ проведения твердофазного иммуноферметного анализа, включающий сенсибилизацию лунок панелей вирусспе- цифическими антителами, последовательное их инкубирование с испытуемым антигеном и конъюгатом антител с ферментом, отмывку несвязывающихся компонентов реакции на каждом этапе ее постановки, отличающийся тем, что, с целью ускорения проведения анализа, каждый этап реакции взаимодействия антигена с антителом проводят при 48-53°Св течение 5-10 мин при постоянном перемешивании реакционной смеси.

Таблица 1

Использование: иммунохимия, способы проведения иммуноферментного анализа антигенов и антител, Сущность изобретения: лунки панелей для твердофазного иммуноферментного анализа сенсибилизируют ви- русспецифическими антителами, инкубируют с испытуемым интигеном и коньюгатом антител с ферментом, проводя кажду стадию при 48-53°С 5-10 мин шивании. 2 табл. при постоянном переме

Таблица 2