Способ получения L-2-амино-4-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты Советский патент 1992 года по МПК C12P13/04 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L-2-ами- но-4-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты, обладающей гербицидной активностью, которая может быть использована в качестве гербицида.

Известен слособ получения L-2-амино- 4-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты формулы

О

II

СН3-р - СН2 СН2-СН- СООН

он

БН.

включающий культивирование штамма- продуцента указанной кислоты с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости.

Недостатком указанного способа является большая длительность процесса, что затрудняет организацию промышленного производства продукта.

Цель изобретения - ускорение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что проводят трансамимирование 4-(гидрокси- метилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутствии глутаминовой или аспар агино- сой кислоты или их смеси в качестве NH2- донора и в присутствии глутаммновая кислота - щавелезоуксусная кислота транс- аминаэы или глутаминовая кислота - пиро- винограднаякислота трансзминазы,или их смеси, или штаммов-продуцентов, указанных трансаминаз: Streptomyces hyjioscoplcus SF-1293 (PERM ВР-130, АГСС 21705); Streptomyces hygroscoplcus NP-50 (PERM BP-1368); Streptomyces llvldans 66 (PERM БР-737); Streplomyces albus IFO 13014(AT CC3004); Streptomyc3sgriseuslFO 12875 (ATCC 23345); Streptoverlcilllum cinnamoneum IFO 12852 (ATCC 11874), Streptomyces morookaensis IPO 13416 (ATCC I916P); Nocardia mediterranei ATCC 21271; Nocardiopsls dassonvlllel ICM 3237; Streptomyces vlridochromogenes IFO 13347 (ATCC14925);Streptomyces

vlridochromogenesICM 4977;

Mlcromonospora carbonaceae NRRL 2972 (ATCC 27114); Escherichla coll ATCC 10798; Pseudomonas aeruglnosa ATCC 10145; Pseudomonas cepacla ATCC 17759; Serratia marcescens ATCC 13880; Candida albicans IAM 4888 или Mucor splnescens 1AM Ми 3 при рН 8,0-9,0, температуре 28-50°С и молярном отношении 4-(гидроксиметилфос- финил)-2-оксомаслпной кислоты и NI-12-донора 1:1-10.

Способ получения аминокислот транс- аминированием соответствующих оксокис- лот в присутствии глутаминовой или аспарагиновой кислот в качестве МНа-доно- ра и ферментов-трансаминаз известен, однакодляполучения| -2-амино-{гидроксиметилфосфинил)-масл- яной кислоты он используется впервые.

Способ согласно изобретению осуществляют следующим образом.

4-{Гидроксиметилфосфинил)-2-оксомас- ляную кислоту обрабатывают по меньшей

мере одной трансаминазой в присутствии по меньшей мере одного МН2-донора, например L-глутаминовой или L-аспарагино- вой кислот или их смеси, в водной среде, в

которой растворены 4-(гидроксиметилфос- финил)-2-оксомасляная кислота, МН2-донор и трансаминаза. Процесс ведут при рН 8,0- 9,0 и температуре 28-50°С. Способ также можно использовать, обрабатывая 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомэсляную кислоту не самой трансаминазой, а штаммом микроорганизма, способным продуцировать по меньшей мере одну трансаминазу. При этом 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-ок- сомасляную кислоту и 1 Ж2-ДОНор вводят в

питательный бульон микроорганизма, способного продуцировать трэнсаминазу, в котором суспендированы не подвергнутые химическому воздействию клетки штамма микроорганизма.

Способ можно осуществлять, обрабатывая 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомас- ляную кислоту экстрактом микроорганизма, способного продуцировать трансаминазу, содержащим эту трансаминазу, в присутствии МН2-донора. Независимо оттого, каким

образом осуществляют способ, 4-(гидрокси- метилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту растворяют с начальной концентрацией ее в водной реакционной среде 0,1-100 мг/мл. Молярное соотношение 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и NH2- донора составляет от 1:1-10 в одной реакционной среде.

При протекании реакции между 4-(гид- роксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислотой, ЫНздонором и трансаминазой или клетками продуцирующего трансаминазу штамма микроорганизма согласно изобретению получается водный реакционный раствор, содержащий -2-амино-4-(оксиметилфосфинил)-масляную кислоту, непрореагировавшую 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомаслян- ую кислоту, используемую трансаминазу или клетки используемого микроорганизма. Перед выделением целевого продукта из реакционной смеси осуществляют центрифугирование для отделения клеток используемого микроорганизма.

Выделение и очистку целевого продукта осуществляют пропусканием реакционной

смеси через колонку с катионообменной смолой, такой как Дауэкс 50W, которой абсорбируется целевой продукт, после чего осуществляют его элюирование водой или / разбавленным водным раствором аммиака.

В результате получают фракции элюата, содержащие Ь2-амино-4-(гидроксиметилфос- финил)-масляную кислоту. Фракции

элюента собирают и концентрируют при пониженном давлении.

Пример. 4-(Гидроксиметилфосфи- нил)-2-оксомасляную кислоту растворяют в 50 Ммоль фосфатного буферного раствора (рН 6), содержащего глутаминовую кислоту - щавелевоуксусную кислоту трансамина- зы, L-аспарагиновую и L-глутаминовую кислоты, служащие в качестве МН2-доноров.

Процесс ведут при 50°С в течение 50 мин. Затем реакционную смесь нагревают при 100°С в течение 3 мин для завершения реакции. Величину рН реакционной смеси доводят до 2 добавлением разбавленного водного раствора серной кислоты и осуществляют центрифугирование для получения поверхностного раствора. Количество целевого продукта в поверхностном растворе определяют аминокислотным анализатором.

П ример2. Штаммы, указанные втабл. 1, подвергают индивидуально инокулирова- нию в 40-миллилитровых порциях среды разведения, включающей питательный бульон, после чего осуществляют культивирование при 28°С в течение б ч. Полученные питательные бульоны используют для ино- кулирования с инокулумом 2% в 40-миллилитровых порциях питательной среды того же состава и кулитивирования в течение ночи при 28°С. В каждый из полученных питательных бульонов, содержащих клетки, вводят 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксо- масляную кислоту до концентрации 100 мкг/мл.

В каждый из полученных бульонов вво- дят натриевую соль L-аспарагиновой кислоты в качестве МН2 донора до концентрации 00 мкг/мл. После этого осуществляют ферментную конверсию, протекающую при 28°С в течение 24 ч. Величину рН получен- ной смеси доводят до 2 посредством 25%- ной серной кислоты для прекращения реакции. Клетки удаляют путем центрифугирования. Количества образующейся L-2- амино-4-(гидроксиметилфосфинил)-масля- ной кислоты, присутствующей в поверхностном растворе, определяют с помощью аминокислотного анализатора.

Результаты суммирования в табл. 1.

П р и м е р 3. Штамм Streptomyces hygroscoplcus SF-1293 (PERM BP-130) ино- кулируют в 10 мл предварительной среды разведения (включающей 2,0% растворимого крахмала, 1,0% полипептона, 0,3% мясного экстракта, 0,05% вторичного кислого фосфата калия, рН 7,0), культивируют при 28°С в течение 24 ч. Полученный питательный бульон используют в качестве затравоч- ной культуры и инокулируют при

содержании инокулума 2% в питательную среду разведения, включающую, %: глюкоза 7; бактозиотон 4,4; вторичный кислый фосфат калия 0,32; вторичный кислый фосфат натрия 0,0852, М-трис-(оксиметил)ме- тил-2-аминоэтансульфоновая кислота 1,15; хлористый кобальт 0,0001 (рН 6,0), и затем осуществляют культивацию штамма SF- 1293 при 28°С в анаэробных условиях и при перемешивании. После культивации в течение 4 дн микробные клетки извлекают центрифугированием и промывают 50 мМ фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Затем эти клетки дезинтегрируют путем ультразвуковой обработки, после чего осуществляют центрифугирование с получением раствора сырого фермента.

В указанный раствор сырого фермента вводят 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксо- масляную кислоту до концентрации 100 мкг/мл и L-аспарагиновую кислоту до концентрации 200 мкг/мл. Осуществляют также контрольный опыт с использованием 2-кетоглутаровой кислоты в качестве контрольного субстрата для реакции трансами- нирования. После протекания ферментной реакции при 30°С в течение 2 ч реакционный раствор нагревают при 100°С в течение 3 мин для завершения реакции.

Величину рН полученного раствора доводят до 2 разбавленной серной кислотой. Раствор целевого продукта получают центрифугированием данного реакционного раствора. Количество целевого продукта и глутаминовой кислоты, образующейся из кетоглутаровой кислоты, определяют с помощью аминокислотного анализатора.

Получают. | -2-амино-4-(гидроксиметил- фосфинил)-масляная кислота - 2,8 мкг/мл; 2-KG глутаминовая кислота 67,9 мкг/мл (контроль).

П р и м е р 4. Используют штамм Streptomyces hygroscopicus NP-50(FERM P- 7804).

В колбе Эрленмейера емкостью 250 мл смешивают 20 мл питательного бульона штамма Streptomyces hygroscopicus NP-50, культивированного в течение 3 дн, 30 мл водного раствора 4-(гидроксиметилфосфи- нил)-2-оксомасляной кислоты (концентрация 87 мг/мл; рН 7,0), 40 мл водного раствора L-глутамата натрия (концентрация 170 мг/мл) и 10 мл молярного буферного раствора трис-HCI (рН 8,5). Процесс ведут при осторожном взбалтывании полученной смеси при 37°С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь центрифугируют для удаления из нее микробных клеток, а поверхностный раствор, содержащий целевой продукт, анализируют с помощью аминокислотного анализатора. Получают 14 мг/мл -2-амино-4-(гидроксиметилфосфи нил)-масляной кислоты.«

П р и м е р 5. Используют штамм Streptomyc.es livldans 66 (PERM BP-737).

В колбе Эрленмейера на 250 мл смешивают 20 мл питательного бульона штамма Streptomyces livldans 66, культивированного в течение 3 дн в питательной среде, 30 мл водного раствора 4-(гидроксиметилфосфи- нил)-2-оксомасляной кислоты (концентрация 87 мг/мл, рН 7,0), 40 мл водного раствора L-глутамата натрия (концентрация 170 мг/мл) и 10 мл 1 молярного буферного раствора трис-HCI (рН 8,5). При осторожном взбалтывании полученной смеси при 37°С осуществляют ферментную реакцию, которая протекает в течение 24 ч. Затем полученнуюреакционнуюсмесьцентрифугируют для удаления из нее микробных клеток. Полученный поверхностный раствор, содержащий образующуюся L-2- амино-4-(гидроксмметилфосфинил)-масля- ную кислоту (100 мл), анализируют с помощью аминокислотного анализатора с определения количества целевого продукта. Получают 6 мг/мл 1 -2-амино-4- (гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты.

Ниже приведены результаты, полученные при использовании различных штаммов бактерий (табл. 2), дрожжей (табл. 3), актиномицетов(табл. 4), грибов (табл. 5), где - глутаминовая кислота, Asp - аспараги- новзя кислота.

В табл. 6 приведены результаты, показывающие зависимость выхода продукта от концентрации МН2-донора и исходной оксо- кислоты.

Формула изобретения

Способ получения -2-амино-4-{гидро- ксиметилфосфинил)-масляной кислоты формулыQ

ш3-р-сн2-С1Гг-сн соон

Ii I

онзш.2

отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса, проводят трансамини- рование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-ок- сомасляной кислоты в присутствии глутаминовой или аспарагиновой кислот

или их смеси в качестве МН2-донора и глутаминовая кислота -щэвелевоуксусная кислота трансаминазы или глутаминовая кислота - пировиноградная кислота трансаминазы,

или их смеси, или штаммов-продуцентов указанных трансаминаз Streptomyces hygroscoplcus SF-1293 (PERM BP-130, АТСС 21705) или Streptomyces hygroscopicus NP- 50 (PERM BP-1368), или Streptomyces

livldans 66 (PERM BP-737), или Streptomyces albus IPO 13014 (ATCC 3004), или Streptomyces grlseus IPO 12875 (ATCC 23345), или Strepto-vlrlcllllum cinnamoneum IPO 12852 (ATCC 11874 ), или Streptomyces

morookaensis IPO 13416 (ATCC 19166), или Nocardla mediterranei ATCC 21271, или Nocardlopsls dassonvlllel ICM 3237, или Streptomyces virldochromogenes ICM 4977, или Streptomyces viridochromogenes IPO

13347 (ATCC 14925), или Mlcromonospora carbonaceae NRRL 2972 (ATCC 27114), или Esherlchia cofi ATCC 10798, или Pseudomonas aeruglnosa ATCC 10145, или Pseudomonas cepacie ATCC 17759, или

Serratla marcescens ATCC 13880, или Candida alblcans IAM 4829, или Mucor spinescens IAM МиЗ при рН 8,0-9,0, температуре 28-50°С и молярном соотношении 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и NH2-flOHopa 1:1-10.

Приоритет по пунктам 9.04.86: проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомаслян- ой кислоты в присутствии глутаминовая кислота - щавелевоуксусная кислота трансами- назы или глутаминовая кислота - пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси, или штаммов-продуцентов указанных трансаминаз, SF-1293 АТСС

10145, АТСС 13880, АТСС 9341.

23.01.87: в присутствии глутаминовой кислоты в качестве МН2-донора, штаммов NP-50-FERMBP-737.

30.03.87: в присутствии штаммов-продуцентов указанных трансаминаз IFO 13014, IFO 12875, IFO 12852, IFO 13416, АТСС 21271, ICM 3237, ICM 4977, IFO 13347. NRRL 2972, АТСС 17759, AM 4829, AM МиЗ.

25,04.87: в присутствии эспарагиновой

кислоты в качестве МН2-донора или их смеси.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 1 -2-амино-4- (гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты, обладающей гербицидной активностью, которая может быть использована в качестве гербицида. Цель изобретения - ускорениепроцесса.Проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфос- финил)-2-оксомасляной кислоты в присутствии ЫН2-донора (глутаминовой или аспара- гиновой кислот, или их смеси) и трансамина- зы (глутаминовая кислота щавелевоуксусная кислота трансаминазы, или глутаминовая кислота - пировиноград- ная кислота трансаминазы, или их смеси) или штаммов-продуцентов указанныхтрансаминаз: Streptomyces hygroscoplcus SF-1293 (PERM BP-130, АТСС 21705) или Streptomyces hygroscoplcus NP- 50 (PERM BP-1368), или Streptomyces Hvidans 66 (PERM BP-737). или Streptomyces albus IPO 13014 (ATCC 3004), или Streptomyces griseus IFO 12875 (ATCC 23345), или Streptovlricillium clnnamoneum IFO 12852 (ATCC 11874), или Streptomyces morookaensls IFO 13416 (ATCC 19166), или Nocardla medlterranei ATCC 21271, или Nocardlopsis dassonvillel ICM 3237, или Streptomyces vlrldochromogenes IFO 13347 (ATCC 14925), или Streptomyces virldochromogenes ICM 4977. или Micromonospora carbonaceae NRRL 2972 (ATCC 27114), или Escherlchia coll ATCC 10798, или Pseudomonas aeruglnosa ATCC 10145, или Pseudomonas cepacla ATCC 17759, или Serratia marcescens ATCC 13880, или Candida alblcans IAM 4829, или Mucor splnescens IAM M и З при рН 8-9, температуре 28-50°С и молярном соотношении 4- (гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и МН2-донора 1:1-1:10. 6 табл. кяяа кс«& о о

Выход продукта в зависимости от штамма

Выход продукта при использовании бактерий

Выход продукта при использовании дрожжей

Выход продукта при использовании актиномицетов

Streptomyces albus IFO 13014 (АТСС 3004)

Streptomyces griseus IFO 12075 (АТСС 23345)

Streptovericilliumi cinnanioneum IFO 12852 (ATCC 11874)

Streptomyces morookaensis IFO 13416 (ATCC 19166)

Nocardia mediterranei ATCC 21271 Nocardiopsis dassonvillei ICM 3237

Streptomyces viridochromogenes IFO 13347 (ATCC 14925)

Micromonopora carbonaceae NRRL 2972 (ATCC 27114)

Streptomyces viridochromogenes ICM 4977

Таблица 2

Таблица 3

Таблица

t,6

1, 5,6

Выход продукта при использовании грибов

8,5.

Примечание: опыт 9 осуществляют при 50°С и рН 9,0, а опыт 11 - при 45°С и рН

Таблица 5

Таблица 6