Способ получения флуоресцирующих антител для диагностики сибирской язвы Советский патент 1992 года по МПК A61K39/40 

(Л

С

Использование: изобретение относится к ветеринарной бактериологии и может быть использовано для диагностики сибирской язвы. Сущность изобретения: Гипериммунизацию продуцентов антисибиреязвенной сыворотки проводят дезинтегратом спор невирулентного штамма Bacillus anthracis СТИ, а перед абсорбцией меченной флуорохромом сыворотки порошками из вегетативных клеток и спор ложносибиреязвенных микробов ее последовательно обрабатывают порошками из спор Bacillus cerens и Bacillus pseudoanthracis.

Изобретение относится к ветеринарной бактериологии и касается методов диагностики для выявления и дифференциации возбудителя сибирской язвы в объектах ветеринарного надзора.

Известен способ получения люминес- цирующих сывороток путем гипериммунизации кроликов споровым антигеном, взятием крови, отделением сыворотки и адсорбции ее неразрушенными спорами шести видов гетерологичных микробов.

Известен также способ получения флуоресцирующих противосибиреязвенкых антител на основе родамина путем адссобции антител порошками вегетативных и споровых клеток близкородственных сибиреязвенной палочке аэробных бацилл.

Недостатком известного способа является использование в работе вирулентных

штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации животных споровым антигеном, что представляет эпидемиологическую опасность и исключает возможность получения антиспоровых сывороток на производстве.

Цель изобретения - обеспечение санитарной безопасности при получении антиспоровых сибиреязвенных сывороток.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения антиспоровых сибиреязвенных флуоресцирующих антител, включающему приготовление спорового антигена с последующей иммунизацией кроликов, забором крови и отделением сыворотки, иммунизацию проводят антигеном, полученным путем автоклавирования и механического разрушения споровой оболочки клеток из вакцинного штамма СТИ,

СО

Ю ГО

обладающего признаками антигенной общности со всеми штаммами возбудителя сибирской язвы, а очистку сыворотки от гетерологичных антител осуществляют путем поэтапного ее истощения иммуноадсорбен- том - порошками из споровых и вегетативных клеток гетерологичных культур.

П р и м е р 1. Иммунизируют кроликов нативными (неразрушенными) автоклави- рованными спорами (антигеном) 10-кратно (5 подкожных и 5 внутривенных введений) с интервалом в 3 дня. Полученные сыворотки испытывают на активность в РИФ со стандартным антигеном. Опыты показывают, что активность сывороток не превышает 1:16.

П р и м е р 2. Иммунизируют кроликов смесью антигенов из 10 вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы, приготовленных путем автоклавирования спор штаммов возбудителя. Результаты опытов показывают, что активность сывороток составляет 1:32.

ПримерЗ. Готовят порошок из спор вакцинного штамма СТИ по предлагаемому методу и им иммунизируют кроликов по общепринятой схеме. Результаты РИФ показывают, что титры антител возрастают до 1:64.

П р и м е р 4. Готовят антиген из разру- шенных спор 10 вирулентных штаммов сибиреязвенного микроба и иммунизируют им кроликов по общепринятой схеме. Титр антиспоровых антител составляет 1:64. Результаты сравнительных опытов по применению споровых антигенов показывают, что антигены из разрушенных спор вакцинного штамма СТИ индуцируют образование антиспоровых антител, титр которых не уступает таковому сывороток, полученных иммунизацией кроликов споровыми антигенами, полученными из 10 вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. Однако антиспоровые сыворотки, полученные иммунизацией кроликов споро- выми антигенами из вакцинного штамма СТИ и 10 вирулентных штаммов сибиреязвенного микроба, обладали одинаковой способностью окрашивать гетероло- гичные антигены (споры перечисленных выше несибиреязвенных штаммов), что предлагает очистку антиспоровых сывороток путем адсорбции иммуносорбентами.

П р и м е р 5. Адсорбция конъюгатов смесью нативных (неразрушенных) спор из 6 видов гетерологичных микробов в течение 18-20 ч при соотношении спор к конъюгату 20 мг на 1 мл. Результаты показывают, что, хотя свечение гетерологичных культур отсутствует, однако титр сывороток падает до

1:4-1:8, что нежелательно для технологической характеристики антиспоровых сывороток.

П р и м е р 6. Адсорбция конъюгатов из б видов спор в течение 18-20 ч при соотношении адсорбента к конъюгату 20мг на 1 мл. Результаты РИФ показывают, что при этом происходит истощение не только гетерологичных, но и гомологичных антител, т.е. сыворотки не окрашивают ни гомологичные, ни гетерологичные споры.

П р и м е р 7. Проводят поэтапную адсорбцию антител иммуноадсорбентами (порошками) из спорообразующих гетерологичных микробов. На первом этапе конъюгат адсорбируют порошком спор Вас. cereus из расчета 6, 9, 10, 11, 12, 14 и 16 мг/мл и адсорбируют в термостате на магнитной мешалке в течение 11, 13, 14,15, 16, 17, 19 и 21 мин. Результаты РИФ показывают, что максимальное удаление гетерологичных антител против использованного антигена достигается при соотношении адсорбента к конъюгату 10 мг:1 мл и времени адсорбции 15-16 мин. Изменение соотношения компонентов в сторону увеличения приводят к резкому снижению титра специфических антител (увеличение времени также приводит к аналогичному эффекту), а снижение соотношения компонентов и времени адсорбции - к неполному истощению гетерологичных антител.

ПримерЗ. Адсорбция конъюгата антигеном (порошком) из Вас. pseudoanthracis. Все процедуры выполняют как в примере 7, но соотношение адсорбента к конъюгату при этом составляет, мг/мл: 4:1, 5:1, 6:1, 6,5:1, 7:1, 7,5:1 и 8:1. Устанавливают, что максимальное удаление гетерологичных антител к указанному виду микробов из конъюгата достигается при соотношении адсорбента к конъюгату (мг/мл) 6,5-7,0:1 при экспозиции 15:16 мин. Изменение указанных параметров адсорбции (увеличение или уменьшение дозы и времени) оказывали отрицательный эффект на степень истощения конъюгата.

П р и м е р 9. Адсорбция конъюгата смесью порошков из спор и вегетативных клеток Вас. cereus из расчета 20-22 мг/мл (10-11 мг порошка из спор + 10-11 мг порошка из вегетативных клеток данного вида микроба) конъюгата проводят как в примере 8. Результаты РИФ показывают, что конъюгат полностью истощается от гетерологичных антител к спорам и вегетативным клеткам всех 6 видов перечисленных выше ложносибиреязвенных сапрофитов.

Полученная описанным способом антиспоровая флуоресцирующая сыворотка по- зволяет обнаружить споры возбудителя

сибирской язвы в объектах ветнадзора и идентифицировать их от спор ложносибире- язвенных микробов.

Предлагаемый способ получения антиспоровой флуоресцирующей сыворотки позволяет исключить из технологии изготовления антиспоровых сывороток использование вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы, делая процесс получения безопасным, сохраняя при этом специфическую активность диагностикума. Формула изобретения Способ получения флуоресцирующих антител для диагностики сибирской язвы,

0

5

включающий гипериммунизацию продуцентов антигеном, отделение сыворотки, конъюгацию с флуорохромом, адсорбцию меченой сыворотки порошками из вегетативных клеток и спор Bacillus cereus при перемешивании, отличающийся тем, что, с целью повышения активности сыворотки и обеспечения санитарной безопасности способа, в качестве антигена используют дезинтеграт высушенных спор штамма Bacillus antracis СТИ, перед адсорбцией меченую сыворотку последовательно обрабатывают порошками из спор Bacillus cereus и спор Bacillus pseudoanthracis.