Способ изготовления аллергена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1992 года по МПК A61K39/35 

Изобретение относится к получению биопрепаратов и может быть использовано в ветеринарной практике для диагностики лейкоза крупного рогатого скота,

Диагностика лейкоза крупного рогатого скота проводится с помощью клинико-гема- тологического метода, основанного на опре- делении количества лейкоцитов и морфологического анализа клеток периферической крови (см. Инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Утв. ГУВ Минсельхоза СССР 25 марта 1974 г.).

Однако гематологический метод не всегда позволяет исключить патологические состояния, нелейкозной этиологии, сопровождающиеся лейкемоидными реакциями, и не выявляет алейкемические формы лейкоза (см: Горбунов А.П. Лейкоцитарный профиль крови и морфологические изменения в органах крови при некоторых заболеваниях, сопровождающихся лейкемоидной реакцией: Автореф. дис. на соиск, учен, степени канд. ветнаук. А. 1971. с. 8; Ефимов А.А, Клинико-гематологические и серологические исследования при лейкозе крупного

vj со

4

XI

О GO

рогатого скота: Автореф. дис. на соиск учен, степени канд. вет. наук. А. 1971, с. 8).

Известны методы серологической диагностики, в частности реакция иммунофлуо- ресценции, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглю- тинации (см: Валихов А.Ф. Сывороточные преципитирующие антитела конкорновиру- су типа С.-Ветеринария, 1976, №1,с.44-46; Кукайн А. А. и др. Выявление специфических антител у больного лейкозом крупного рогатого скота/В кн.: Вирусы рака и лейкоза. - М.: 1976, с. 80; Крикун В.А. и др, Обнаружение антител к р24 и гликопротеидному антигенам вируса бычьего лейкоза (БЛВ) у крупного рогатого скота при экспериментальной и спонтанной инфекции(Сб.научи, тр. Моск. вет. акад., 1979, т. 107, с. 19-20).

Однако диагностическая эффективность этих реакций различна. Поэтому при- менение одной из них как самостоятельного диагностического теста недостаточно для выявления больных лейкозом животных.

В настоящее время основным серологическим методом диагностики лейкоза явля- ется реакция иммунодиффузии в геле (РИД) (см. Инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота ГУВ МСХ. 1985).

Недостаток этого способа состоит в том, что он недостаточно чувствителен и не всегда позволяет выявлять животных, у которых титры противовирусных антител низкие.

Аллергический метод является более достоверным и эффективным по сравнению с указанными. Он прост в осуществлении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Аллергена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота не имеется.

Наиболее близким к предлагаемому является способ приготовления аллергена для диагностики рака желудка у людей по кожной реакции путем гомогенезации тканей и выделения микросомной фракции.

В качестве исходного материала используют опухолевую ткань после хирургического удаления раковой опухоли желудка (см,: Зильбер Л.Н. и др. Кожные реакции у больных с антигенами из рака желудка. - Вопросы онкологии, 1969, т. 15, Ns 5, с. 18- 24).

Известен способ приготовления аллергена из вируса крупного рогатого скота, ис- пользуя при этом клеточную культуру ФЛК, перманентно продуцирующую ВЛКРС (см. Генов И., Цуцуманский В. Приложение на аллерген за диагностика на левкозата по животнице. - Вет. сбирка, 1979, № 2, с. 7-9;

Генов И. и др. Опыты за получавание и приложение на аллерген за диагностика на левкозата по животнице. - Вет. мед. науки, 1980, т. 17, №2. с. 42-47).

Однако аллергены, полученные известными способами, неприемлемы для практического применения, так как обладают антигенными свойствами. Кроме того аллергены, полученные известными способами, содержат нуклеиновые кислоты как вирусного, так и клеточного происхождения, которые опасны как источник опухолевой информации с потенциальной возможностью индуцирования опухолевого заболевания.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности аллергена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве материала используют бластт- рансформированные лейкоциты краткосрочныхкультурлейкоцитовпериферической крови больных лейкозом коров, в питательную среду, содержащую 10-20% эмбриональной сыворотки, добавляют 0,004-0,005 мг/мл фитогемагглютини- на, снятые клетки гемогенизируют в двух-трех объемах 0,15 М NaCI, выделяют из них микросомную фракцию методом дифференциального центрифугирования, обрабатывают ее тритоном до конечной концентрации 0,5-1,0%, сорбируют против нормальных клеточных антигенов, стандартизируют по белку до 2-3 мг/мл, добавляют гипсофилин до концентрации 0,6-0,8 мг/мл и инактивируют гамма-лучами в дозе 15-17 кгр в течение 24-25 ч.

Преимущество предлагаемого способа состоит в том, что полученный этим способом препарат не обладает антигенными свойствами и не содержит неинактивиро- ванные нуклеиновые кислоты, которые могут быть источником инфекции опухолевого процесса.

Способ осуществляется следующим образом.

Из периферической крови больных лейкозом коров путем гематологического шока выделяют лейкоциты, которые в концентрации 4-6-10 кл./мл вносят в питальную среду 199, содержащую 10-30% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина и 0,004-0,005 мг/мл фитогемагглютинина, и культивируют 72 ч. Полученные бласттранс- формированные клетки осаждают центрифугированием при 800-1000 об./мин в течение 15-20 мин, трехкратно замораживают, гемогенизируют в двух-трех объемах

0,15 M NaCI и подвергают дифференциальному центрифугированию. Вначале удаляют из гомогената ядра, неразрушенные и обрывки клеток центрифугированием при 2000-2500 тыс. об./мин в течение 15-20 мин, отбрасывают осадок, надосадочную жидкость снова центрифугируют при 18-20 тыс. об./мин. Затем надосадочную жидкость 20-25 мин снова центрифугируют при 30 тыс. об./мин 1,5-2,0 ч, полученный мик- росомальный осадок промывают 0,14 М NaCI три раза и ресуспендируют в 0,5 объеме 0,15 М NaCI при помощи гомогенизатора Поттера.

Полученную суспензию микросом разрушают тритоном до конечной концентрации 0,5-1,0%, сорбируют против нормальных клеточных антигенов иммуно- сорбентом, для приготовления которого используют иммунную кроличью сыворотку против пула лейкоцитов периферической крови (3-5 голов) здорового крупного рогатого скота (см. табл. 1).

Кроликов иммунизируют по схеме, приведенной в табл.1.

Изготовление иммуносорбента.

К10 мл антисыворотки кроликов против пула лейкоцитов здорового крупного рогатого скота добавляют 3 мл 2,5%-ного раствора глутарового альдегида. Гель, сформировавшийся в течение 20 мин при 37°С, затем 3 ч при комнатной температуре, измельченный в гомогенизаторе и отмытый физраствором, сшивают с белковой фракцией из расчета 500 мг на 1 мл. Инкубируют при 37°С 20 мин, затем в холодильнике +4°С в течение 12-18 ч. Белковую фракцию от иммуносорбента отделяют центрифугированием при 5000 об./мин в течение 20 мин. Полученный препарат стандартизируют по белку 2-3 мг/мл, добавляют в него 0,6-0,8% гипсофилина и подвергают инактивации гамма-лучами в дозе 15-17 кгр в течение 24 ч. Это и есть аллерген.

Аллерген проверяли на стерильность путем высева на питательные среды (мясо- пептонный бульон, мясопептонный агар, мясопеченочный бульон под вазелиновым маслом). На питательных средах в течение 10 суток не было роста микрофлоры,

Безвредность препарата проверяли на белых мышах (массой 10-12 г) путем внутри- брюшинного введения препарата в дозе 0,2, 0,5, 1,0 мл. Каждая доза 3 мышам. Контроль - 10 мышей. Наблюдение 10 дней. Аллерген считали безвредным, так как в течение 10 дней после его введения животные были живы и клинически здоровы.

Токсичность препаратов проверяли на кроликах однократным внутрикожным введением 5 кроликам по 0,2 мл препарата. Контрольным кроликам (5 голов) вместо аллергена вводили физиологический раствор. Препарат не вызывал некроза кожи,

Сенсибилизирущие свойства препарата

изучали на кроликах путем внутрикожного его введения в область предплечья в дозе 0,3 мл с интервалом в 5 дней. Контрольным животным вводили препарат, аналогично

0 приготовленный из бласттрансформиро- ванных лимфоцитов периферической крови здоровых коров. Через 15 дн. после последнего введения препарата обеим группам животных вводили аллерген в той же дозе и

5 в то же место (разрешающая инъекция). Учет реакции на введение аллергена производили через 24, 48 и 72 ч. По характеру местной реакции и ее отсутствию судили о сенсибилизирующих свойствах аллергена.

0 Антигенные свойства проверяли на животных, указанных выше. У подопытных животных была взята кровь для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в РИД. По наличию или отсутствию

5 антител к ВЛКРС судили об антигенных свойствах препарата.

Установлено, что местная и общая реакция на введение разрешающей дозы аллер- генов у кроликов отсутствовала. В

0 сыворотке крови антитела к ВЛКРС в РИД не обнаружены. Следовательно, аллерген в вышеуказанной дозе не обладает сенсибилизирующими и антигенными свойствами. В работе использовали стерильный без5 вредный не токсичный препарат, лиофильно высушенный в виде аморфной массы розовато-белого цвета, хранящийся при 2-8°С.

Эффективность и специфичность аллергена изучали в опыте на 15 кроликах, инфи0 цированных ВЛКРС путем внутривенного введения каждому животному по 10-20 мл (двукратно с интервалом в 10 дней)вируссо- держащей жидкости культуры ФЛК, постоянно продуцирующей вирус лейкоза

5 крупного рогатого скота. Для контроля служили 3 интактных кролика и 3 кролика, которым внутривенно аналогично введена культуральная жидкость интактной культуры ФЛК. Кролики находились под опытом в

0 течение 5 мес. Через каждые 10 дн. после заражения в течение всего срока опыта производили взятие крови для серологического и гематологического исследований.

В результате заражения кроликов в 80%

5 случаев были выявлены антитела к ВЛКРС в реакции иммунодиффузии.

Всем животным аллерген вводили в дозе 0,2 мл внутрикожно в область левого предплечья. Одновременно с противоположной стороны в таком же количестве вводили препарат, приготовленный аналогично из бласттрансформированных лейкоцитов здоровых коров. Учет реакции производили через 24 и 48 ч.

Окончательную реакцию учитывали через 72 ч. При этом реакция оценивалась по наличию инфильтрации (отека) и гиперемии на месте введения препарата. Местная реакция считалась положительной при наличии инфильтрации от 0,5 см и более с гиперемией в окружности. При наличии гиперемии без инфильтрации реакция расценивалась, как сомнительная. При этом изучено время проявления и длительность кожно-аллергической реакции и характер ее проявления.

При внутрикожном введении аллергена у 78,5% инфицированных ВЛКРС кроликов отмечена кожно-аллергическая реакция в виде ограниченной гиперемии от 0,9 до 2,5 см в диаметре, с утолщением кожной складки от 0,5 до 1,1 мм.

Экспериментальные препараты испытаны на спонтанно инфицированных ВЛКРС телятах (10 голов), которые были подобраны в неблагополучном по лейкозу хозяйстве по трехкратному серологическому исследованию по РИД. 5 интактных телят - контроль. Аллерген вводили по 0,2 мл в правую подхвостовую складку, в левую - препа- рат, приготовленный аналогично из бласттрансформированных лимфоцитов здоровых коров,

Реакцию учитывали через 24 и 48 ч после инъекции. Проявление кожной пробы оценивали путем осмотра и измерения толщины подхвостовой складки.

Реакция на введение аллергена характеризовалась утолщением подхвостовой складки у 7 телят от 11 до 17 мм, у 3 телят толщина ее была в пределах от 8 до 11 мм при норме 5-7 мм. В то время, как кожно-аллергическая реакция на интактный аллерген у контрольных телят - отсутствовала.

Отдельные исследования были посвящены определению оптимального содержания белка. Для этого было приготовлено 4 серии аллергена с содержанием белка соответственно:

1серия - 1,0 мг/мл;

2серия - 2,0 мг/мл;

3серия - 3,0 мг/мл;

4серия - 4,0 мг/мл.

В препарат каждой серии добавляли по 0,8 мг/мл гипсофилина и подвергали инактивации гамма-лучами в дозе 15 кгр в течении 24 ч

Специфичность аллергена каждой серии проверяли на 3 телятах, инфицированных ВЛКРС. Контроль - (по 2 теленка на

каждую серию) интактные животные. Препарат вводили внутрикожно в правую под- хвостовую складку в дозе 0,2 мл. Одновременно в левую подхвостовую

складку вводили культуральную жидкость или интактный аллерген с таким же содержанием, 0,8 мл гипсофилина. Результаты учитывали через 24, 48 и 72 ч.

Установлено, что наиболее выраженная

0 реакция проявлялась при введении 2, 3 и 4 серии (реагировали все 9 инфицированных животных).

При введении аллергена первой серии кожная реакция отмечена у одного из трех

5 телят. В первом случае реакция проявлялась через 24 ч и сохранялась до 72 ч, во втором - через 24 ч реакция исчезала.

Таким образом, оптимальной концентрацией белка в аллергене явилось содержа0 ние его 2,0-3,0 мг/мл. Увеличение концентрации антигена не приводило к улучшению качества препарата, а снижение уменьшало его активность,

Определение оптимальной дозы аллер5 гена проводили на 15 телятах, спонтанно инфицированных ВЛКРС и разделенных на 3 группы по 5 животных в каждой,

Животным первой группы аллерген вводили внутрикожно в область правой подхво0 стовой складки в дозе 0,1 мл, второй группе - 0,2 мл, третьей группе - 0,3 мл с 0,8 мг/мл гипсофилина. Одновременно в левую подхвостовую складку вводили культуральную жидкость с таким же содержанием гипсофи5 лина.

Контролем служили 3 группы незараз- ныхтелят(по2 вкаждой), которым аналогично вводили контрольный препарат, Результаты учитывали через 24, 48 и 72 ч.

0 Установлено, что наиболее выраженная реакция проявлялась при введении аллергена в дозах 0,2 и 0,3 мл (реагировали большинство инфицированных ВЛКРС телят). При введении аллергена в дозе 0,1 мл реа5 гировали 2 из 5 животных.

У интактных животных реакция была отрицательной.

Таким образом, оптимальной дозой при внутрикожном введении аллергена являет0 ся 0,2-0,3 мл, оптимальными сроками учета реакции -48 и 72 ч после введения аллергена.

Для определения оптимальной концентрации гипсофилина в аллергене в препарат

5 с содержанием белка 2,0 мг/мл его было внесено 0,5 мг/мл (1 серия), 0,6 мг/мл (2 серия), 0,8 мг/мл (3 серия), 1,2 мг/мл (4 серия).

Активность аллергена каждой серии проверяли на 3 инфицированных ВЛКРС

животных и на 2 интактных животных. Вводили препарат и учитывали реакцию по такой же методике и в те же сроки, что и в предыдущем опыте.

Аллергическая реакция зарегистрирована у всех инфицированных ВЛКРС животных.

Наиболее выраженной она была при введении аллергена с содержанием 0,6- 0,8% гипсофилина соответственно.

У контрольных животных при введении аллергена всех серий реакция была отрицательной. Однако введение аллергена (4 серии) с 1,2% содержанием гипсофилина приводило к появлению некроза как у опытных, так и у контрольных животных.

Следовательно, оптимальной концентрацией гипсофилина в аллергене является 0,6-0,8%. Уменьшение ее снижает активность аллергена, а увеличение может вызвать некротические явления.

Оптимальные параметры инактивации препарата определяли по биопробе на кроликах, зараженных по схеме, приведенной в табл.2.

Для определения полноты инактивации аллерген с содержанием белка 2 мг/мл и содержанием гипсофилина 0,8 мг/мл подвергали облучению гамма-лучами в дозах 7, 15, 17, 20 кгр, а также их воздействию при комнатной температуре в течение 12, 24, 48 и 72 ч.

Каждой серией препарата заражали кроликов (по схеме). Наблюдение за кроликами 20 дней. О результатах заражения судили по РИД, Для этого через 20 дн. после заражения брали кровь из уха для получения сыворотки. В качестве диагностикума служил антиген ВЛКРС. Аллерген считали полно инактивированным при отсутствии антител к ВЛКРС в сыворотке крови кроликов, зараженных аллергеном.

Установлено, что полная инактивация аллергена происходит при облучении препарата гамма-лучами в дозе 15-17 кгр и выше в течение 24 ч. (У подопытных животных не выявлены антитела к ВЛКРС). Полная инактивация аллергена отмечалась при воздействии гамма-лучами в дозе 7 кгр в течение 48 ч.

Таким образом, оптимальными параметрами инактивации аллергена следует считать воздействие гамма-лучами в дозе 15 кгр, экспозицию 24 ч. Уменьшение этих параметров не приводило к полной инактивации, а увеличение является нецелесообразным.

Антигенные свойства аллергенов, полученных по известному и предлагаемому способам, проверяли на кроликах путем

внутрикожного его введения в область предплечья в дозе 0,3 мл с интервалом в 5 дней. Через 15-20 дн. после последнего введения препарата брали кровь для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в РИД. На каждый препарат по 15 кроликов. По наличию или отсутствию антител к ВЛКРС судили об антигенных свойствах.

0 Результаты исследований отражены в табл. 3.

Следовательно, предлагаемый аллерген не обладает антигенными свойствами по сравнению с известным препаратом и при5 емлем для практического применения.

Отдельные опыты проведены по изучению чувствительности и специфичности в сравнении предлагаемого и известного аллергенов.

0 Для этого в неблагополучном по лейкозу хозяйстве по результатам двукратных серологических исследований (по РИД) подобрана группа телят (13 голов) десятимесячного возраста, положительно реагирующих на

5 лейкоз в РИД, и 3 теленка с сомнительной РИД. Для контроля брали 5 сероотрицатель- ных телят.

Кожно-аллергическую реакцию ставили путем внутрикожного введения по 0,2 мл в

0 правую подхвостовую складку подопытным и контрольным животным известного препарата, в левую аналогично вводили предлагаемый препарат. Результаты исследований отражены в табл. 4.

5 Данные табл. 4 свидетельствуют, что кожно-аллергическая реакция по кожной пробе через 24 ч после введения аллергенов характеризовалась утолщением подхвосто- вой складки от 13 до 16 мм и от 10 до 13 мм

0 соответственно на предлагаемый и известный аллерген. При этом в первом случае реакция сохранялась 72 ч, во втором - исчезала через 48 ч. Положительный эффект составил 84,6 и 53,8% соответственно в

5 первом и втором случаях.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов было установлено, что полученный препарат является высокоспецифичным и позволяет поставить поло0 жительный диагноз на лейкоз.

Аллерген для диагностики лейкоза кожной пробой прошел с положительным результатом комиссионную проверку внутри института (акт от 26 июня 1987 г., акт от 28

5 сентября 1988г.).

Формула изобретения Способ изготовления аллергена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий культивирование вируссодер- жащих клеток в питательной среде с последующим съемом урожая клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности целевого продукта, из клеток используют бластт- рансформированныелейкоциты

краткосрочных культур лейкоцитов периферической крови больных лейкозом коров, в питательную среду, содержащую 10-20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, добавляют 0,004-0,005 мг/мл фи- тогемаггл ютинина, снятые клетки

0

гомогенизируют в двух-трех объемах 0,15 М NaCI, выделяют из них микросомную фракцию методом дифференциального центрифугирования, обрабатывают ее тритоном Х-100 до конечной концентрации 0,5-1,0%, сорбируют против нормальных клеточных антигенов, стандартизируют по белку до 2- 3 мг/мл, добавляют гипсофилин до концентрации 0,6-0,8 мг/мл и инактивируют гамма-лучами в дозе 15-17 кгр в течение 24-25 ч.

Таблица

Изобретение относится к получению биопрепаратов и может быть использовано в ветеринарной практике для диагностики лейкоза крупного рогатого скота кожной пробой. Цель изобретения - изготовление высокочувствительного аллергена для диагностики лейкоза крупного рогатого скота кожной пробой. Аллерген для диагностики лейкоза крупного рогатого скота содержит белковую фракцию бласттрансформирован- ных лимфоцитов краткосрочных культур лейкоцитов больных лейкозом коров, гипсофилин и физраствор при следующем содержании компонентов: концентрация белка - 2-3 мг/мл; гипсофилин - 0,6-0,8 мг/мл; физраствор до 1 мл. Способ изготовления аллергена включает использование в качестве материала бласттрансформиро- ванных лимфоцитов краткосрочной культуры лейкоцитов больных лейкозом коров, в которую для повышения урожая бласттран- сформированных клеток добавляется фито- гемоагглютинин, выделение белковой фракции проводят путем разрушения тритоном Х-100 и сорбирования против нормальных клеточных антигенов добавления гипсофилина инактивации гамма-лучами и стандартизации по белку 4 табл. (Л С

Сравнительные данные по изучению антигенных свойств известного и предлагаемого аллергенов

15

Таблица2

20

Таблица 3

Сравнительное испытание предлагаемого .и известного аллергенов в кожно-аллергичес ой реакции на их активность и чувствительность

Таблица 4