Способ получения посевного материала - продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса SтRертомUсеS сRемеUS SUвSр.NевRамсYINI Советский патент 1992 года по МПК C12P19/50 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к способу получения аминогликозидного антибиотического комплекса, со- стоящего из карбамоилтобрамицина (тобрамицин - медицинский препарат, представляет интерес в химиотерапии инфекций, обусловленных грамотрицательны- ми бактериями, в том числе Ps. aeruginosa), карбамоилканамицина и апрамицина (применяется в ветеринарии при лечении желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота и свиней).

Известен способ получения посевного материала, когда вегетативный посевной материал культуры Streptomyces cremeus subsp. nebramycini выращивается на посевной среде следующего состава, мае % куку- рузный экстракт 2.0; глицерин 2,0;

хлористый аммоний; хлористый натрий 0,3; мел 0,5; животный жир 0,75.

Посевной мицелий к моменту передачи на стадию ферментации должен удовлетворять следующим требованиям: рН 5,5-7,0; внешний вид культуры; мелкий мицелий, заполняет весь объем пробы, при стоянии мицелий не оседает. Микроскопическая характеристика мицелия; в препарате, окрашенном метиленовым синим, наблюдаются короткие слабоветвящиеся, базофильные гифы.

Недостатком известного способа является низкая антибиотическая активность культуральной жидкости в конце ферментации.

Цель изобретения - увеличение антибиотической активности культуральной жидкости, что приведет к снижению себестоимости антибиотиков тобрамицина и апрамицина.

XI

W

ел

со о о

Поставленная цель достигается тем, что при выращивании вегетативного инокулята определяют дегидрогеназную активность мицелия путем обесцвечивания раствора метиленовой сини и при обесцвечивании в течение 1-2 мин (рН среды 7,2-7,5) и наличии отдельных сплетений гиф отбирают кондиционный материал.

В известном способе физиологическое состояние культуры Streptomyces rimosus, продуцента окситетрациклина, определяют по окислительно-восстановительной (дегид- рогеназной) активности мицелия. Дегидрогеназную активность продуцента измеряют по скорости обесцвечивания красителя ме- тиленового синего. Для культуры Streptomyces cremeus subsp. nebramycini дегидрогеназная активность, измеренная по известной методике, может быть охарактеризована временем обесцвечивания 0,01 %-ного раствора метиленовой сини. Установлено, что кондиционный посевной материал имеет дегидрогеназную активность 1-2 мин. Однако данный параметр не может быть единственной характеристикой кондиционности вегетативного инокулята, так как те же значения дегидрогеназной активности возможны при наличии в посевном материале большого количества лизированной биомассы. Для точного отбора кондиционного посевного материала нужно ввести дополнительно еще 2 параметра: морфология культуры при микроско- пировании - отдельные сгглетения гиф и рН среды - 7,2-7,5. Только 3 параметра в совокупности позволяют получить кондиционный посевной материал, использование которого в дальнейшем на стадии ферментации дает максимальную антибиотическую активность культуральной жидкости. Значение дегидрогеназной активности более 2 мин свидетельствует о недостаточной зрелости мицелия продуцента, т.е. он будет малопродуктивен на стадии ферментации. Значение дегидрогеназной активности меньше 1 единицы свидетельствует о сильном автолизе культуры.

Пример 1 (по известному способу). В качестве объекта исследования используют культуру Streptomyces cremeus subsp. nebramycini (штаммы 2242, 9871). Вегетативный инокулят выращивают при 37°С в течение 24 ч в колбах на качалке с числом оборотов 240 об/мин и в посевном аппарате вместимостью 7 л (коэффициент заполнения 0,7) с числом оборотов мешалки 150 об/мин на среде следующего состава, мас.%: глицерин 2,0; кукурузный экстракт 2,0; животный жир 0.75; хлористый аммоний

0,2; хлористый натрий 0,3; мел 0,5; водопроводная вода остальное; рН среды 7,4±0,1.

Посевной материал (рН 6,0), не содержащий посторонней микрофлоры, имеющий

внешний вид: мелкий мицелий, заполняет весь объем пробы, при стоянии не оседает. Микроскопическая характеристика: в препарате, окрашенном метиленовым синим, наблюдаются короткие слабоветвящиеся,

базофильные гифы в количестве 2% от объема культуральной жидкости используют при проведении ферментации при 37±1°С в аппаратах вместимостью 30 л (коэффициент заполнения 0,5) и в колбах ( 100 мл среды; Vioo 25 мл среды) на качалке с числом оборотов 240 об/мин на среде следующего состава, мас.%: мука соевая 3,5; животный жир 1,1; глюкоза 1,5; хлористый аммоний 0,6; сернокислый магний 1,1; мел 0,7; водопроводная вода остальное; рН среды 6,2 ± ±0,1.

Продолжительность ферментации 72 ч. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом

диффузии в агар с использованием тест- культуры Bacillus subtilis штамм 6633 и выражают в единицах на 1 мл. Суммарная антибиотическая активность культуральной жидкости 2800 мкг/мл для штамма 9871 и

1400 мкг/мл для штамма 2242.

Примеры 2-7. Выращивание вегетативного инокулята проводят на посевной среде прототипа в течение 24 ч при 37±1°С в колбах на качалке с числом оборотов

240 об/мин и в посевном аппарате вместимостью 7 л (коэффициент заполнения 0,7) с числом оборотов 150 об/мин.

Кондиционность вегетативного инокулята определяют 3 параметрами в

совокупности: морфология при микроско- пировании - отдельные сплетения гиф; рН культуральной жидкости 7,2; время обесцвечивания 0,01 %-ного раствора метиленовой сини (1 мл раствора + 5 мл

культуральной жидкости) 1 мин.

Кондиционный посевной материал используют при проведении ферментации в аппаратах вместимостью 30 л (коэффициент заполнения 0,5), в колбах ( 100 мл

среды) на качалке с числом оборотов 240 об/мин, добавляя его в количестве 5% от объема культуральной жидкости. Ферментации проводят при 37±1°С на ферментаци- оннойсредепрототипа.

Продолжительность ферментации 72 ч. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis штамм 6633 и выражают в

единицах на 1 мл. Суммарная антибиотическая активность культуральной жидкости 3640 мкг/мл для штамма 9871 и 1820 мкг/мл для штамма 2242.

Применение вегетативного инокулята, кондиционность которого определяют по одному параметру (по морфологии при мик- роскопировании как в случае с прототипом), приводит к потере активности на стадии ферментации в силу использования еще мо- лодого или переросшего посевного материала.

Полученные данные по влиянию отдельных характеристик вегетативного инокулята на содержание аминогликозидного коми- лекса в культуральной жидкости представлены в таблице.

Приведенные примеры показывают, что только определение кондиционности посевного материала по 3 параметрам в совокуп- ности приводит к увеличению

актибиотической активности культуральной жидкости на 30%.

Формула изобретения Способ получения посевного материала - продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса Streptomyces cremeus sub-sp. nebramycini, включающий выращивание культуры в жидкой питательной среде с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры и рН среды, отличающийся тем, что, с целью увеличения антибиотической активности культуральной жидкости, при отборе определяют дегидрогеназную активность мицелия путем обесцвечивания раствора метиленово сини и при обесцвечивании в течение 1-2 мин, рН среды 7,2-7,5 и наличии отдельных сплетений гиф отбирают кондиционный материал.

Использование: в микробиологической и медицинской промышленности при получении аминогликозидного антибиотического комплекса, состоящего из карбамоилтобрамицина, карбамоилканами- цина и апромицина. Сущность изобретения: вегетативный инокулят выращивают в жидкой питательной среде в течение 24 ч при перемешивании и аэрации с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры, рН среды и дегидрогеназной активности мицелия. Увеличение содержания антибиотиков в культуральной жидкости на 30% достигается посредством использования на стадии ферментации вегетативного инокулята, обесцвечивающего раствор метиленовой сини в течение 1-2 мин при рН среды 7,2-7,5 и имеющего морфологию в виде отдельных сплетений гиф. 1 табл.