Способ анализа воды на содержание вируса гепатита А Советский патент 1992 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита А, в частности выделению вируса гепатита А из объектов окружающей среды, а именно воды.

Известен способ анализа воды на содержание вирусов, основанный на пропускании воды через мембранные фильтры Јlj- Данный способ заключается в адсорбции вирусов на мембране с размером пор порядка 0,5 мкм с последующей их десорбцией, Известен также способ анализа воды на содержание вирусов, основанный на адсорбции виру- icoB на пористых кремнеземах YJ . Недостатком описанных способов анализа воды на содержание вирусов является: для первого способа - необходимость наличия специального дорогостоящего .оборудования и материалов (микрофияьт- ры), для второго использование для анализа лишь небольших объемов (до 10 л) вирусосодержащей жидкости, что резко снижает потенциальные возможности метода,

Наиболее близким по технической сущности и ожидаемому положительному эффекту к предлагаемому изобретению является способ анализа воды на налиК|

Со СЛ

--J

ОЭ -4

мие энтеровирусов, основанный на адсорбции их на аморфном осадке гидра- тт окиси алюминия Гз.

Авторами был воспроизведен данный способ применительно к анализу различных видов воды на содержание вируса гепатита А, Способ заключается в следующем. В приготовленные модельные растворы с известным содержанием вируса гепатито А вносят аморфный гид- рот окиси алюминия, доводят рН до уровня 3,0-,5 соляной кислотой и при перемешивании инкубируют в течение ночи. Осадок отделяют низкоскоростным центрифугированиемD Злюцию вируса осуществляют 0,05 М глициновым буфером рН 11,5, нейтрализуют рН 7,0-8,0 0,05 М глициновым буфером рН 1,5, проводят антимикробную обработку хлороформом, концентрируют ультрафильтрацией до минимального объема и анализируют на наличие специфической антигенной активности вируса гепатита А при помощи иммуноферментного анализа (ИФА)

Однако к недостаткам способа относится:

- невысокая степень выявления вируса гепатита А, которая составляет в среднем 20-25 о от внесенного количества и возможность осуществлять анализ небольших объемов жидкости, поскольку возникают технологические трудности в выделении осадка.

П р и м е р 2. Проведение анал осуществляют как в примере 1, за ключением того, что вместо культу ного вируса гепатита А (штамм НА используют дикий вирус, выделен

Результаты полностью идентичны ченным с использованием культурал го вируса,

П р и м е р 3. Проведение анал осуществляют, как в примере 1, за что для проведени

ключением того,

Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепати- 35 от больного вирусным гепатитом А. та А в больших объемах воды разной степени загрязненности и его упрощение.

Поставленная цель достигается тем, что вместо аморфного гидрата окиси 40 алюминия для адсорбции вируса гепатита А из воды используют кристаллический гидрат окиси алюминия в форме гид- рэргиллита,.

Способ осуществляют следующим образом.

Анализируемую воду подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают через одну или несколько колонок, заполненных кристаллическим Уидратом окиси алюминия из расчета см на 10 л анализируемой воды со скоростью 1,0-20 мл/мин, элюцию проводят 0,05 М глициновым буфером рН 11,5, нейтрализуют рН до 7,0-8,0 0.05 М глициновым буфером рН 1,5, затем осуществляют антимикробную обработку хлороформом, доводят объем элю50

анализа используют сточную воду. личественное содержание антигена Д5 са гепатита А, определяемое при п ИФА, составляет в данном случае 8

от внесенного количества. i

П р и м е р 4. Сточную воду об мом 1 л с внесенным в нее вирусом патита А в концентрации в 100 раз меньше минимально детектируемой м дом ИФА подкисляют соляной кислот уровня рН 3,0-4.5 и пропускают че колонку с кристаллическим гидрато окиси алюминия с различной скорос

Установлено, что сорбционная е кость гидрата окиси алюминия была симальной и оставалась неизменной

55

10

357674

эта ультрафильтрацией до нескольких миллилитров и анализируют на наличие специфической антигенной активности вируса гепатита А при помощи ИФА4

Способ поясняется следующими примерами 6

Пример. Питьевую воду объемом 10 л с внесенным в нее культураль- ным вирусом гепатита А (штамм НА - 15) в концентрации в 1000 раз меньше минимально детектируемой методом ИФА, подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4,5 и пропускают через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия объемом 1 см3 со скоростью 10-20 мл/мин. После прохождения воды через колонку пропускают десорбирую- щий 0,05 М глициновый буфер рН 11,0„ Элюат нейтрализуют до уровня рН 7,0- б,0, используя 0,05 М глициновый буфер рН 1,5, проводят антимикробную обработку хлороформом, концентрируют ультрафильтрацией до конечного объема 5 мл и анализируют на наличие специфической активности при помощи Проводят количественное определение антигена вируса гепатита А, которое в данном случае составляет 98% от внесенного.

П р и м е р 2. Проведение анализа осуществляют как в примере 1, за исключением того, что вместо культураль- ного вируса гепатита А (штамм НА - 15) используют дикий вирус, выделенный

5

20

25

30

35 от больного вирусным гепатитом А.

Результаты полностью идентичны полученным с использованием культурально- го вируса,

П р и м е р 3. Проведение анализа осуществляют, как в примере 1, за ис- что для проведения

ключением того,

от больного вирусным гепатитом А.

анализа используют сточную воду. Количественное содержание антигена виру- са гепатита А, определяемое при помощи ИФА, составляет в данном случае 80 от внесенного количества. i

П р и м е р 4. Сточную воду объемом 1 л с внесенным в нее вирусом гепатита А в концентрации в 100 раз меньше минимально детектируемой методом ИФА подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3,0-4.5 и пропускают через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия с различной скоростью.

Установлено, что сорбционная емкость гидрата окиси алюминия была мак- симальной и оставалась неизменной при

10

15

скорости пропускания сточной воды через колонку от 1 до 20,0 мл/мин. Даль- нейшее увеличение скорости лимитировалось гидравлическим сопротивлением и забиванием колонки взвешенными в сточной воде твердыми частицами.

П р и м е р 5. Проведение анализа осуществляют, как в примере 3, но анализируемую сточную воду перед пропусканием через колонку с кристаллическим гидратом окиси алюминия не подкисляют. Установлено снижение выхода вируса до 50%.

Оптимальную адсорбцию получают при значениях рН между 3.0-,5 (см.черт.).

Приме р60 Проведение анализа осуществляют, как в примере 1 за исключением операции элюирования, которую проводят с использованием различных десорбирующих буферов В таблице приведены результаты использования в качестве десорбирующих буферов 0,5 М три - буфера с рН 8,56; 0.5 М фосфатного буфера с рН 8,2; 3% мясным экстрактом с рН 9,0; 0,05 глициновым буфером с рН 11,5о

Представленные в таблице результаты свидетельствуют, что наилучшие результаты получают при использовании в качестве десорбирующего 0.05 М глицинового буфера с рН 11,5.

Примеру. Сточную В.ОДУ объемом 3Q мл отобранную из канализационного коллектора детского дошкольного учреждения по эпидемическим показа- 35 ниям (зарегистрировано несколько случаев заболеваний вирусным гепатитом А), подкисляют соляной кислотой до уровня рН 3.0-,5 и пропускают через две колонки с кристаллическим гид- 40 ратом окиси алюминия общим объемом 20 см3 со скоростью мл/мин. После прохождения воды пропускают де- сорбирующий 0,05 М глициновый буфер 11,5 нейтрализуют до уровня .0,

используя 0,05 глицинов рН 1,5.

Злюаты с колонок объ изводят антимикробную о формом, концентрируют у цией до конечного объем зируют на наличие специ генной активности при п тиген вируса гепатита А в разведении 1:8, Кроме элюата после дополнител дения от контаминирующе ной флоры при помощи ст фильтрации была использ жения культуры клеток F трек пассажей вирус геп наружен при помощи ИФА, гепатита А подтвердили, 2Q непрямой иммунофлюоресц Использование предложен позволит увеличить степ вируса гепатита А, кото от вида и степени загря лизируемой воды по сра вестным способом, а такж тельно упростить анализ ключения этапа низкоско рифугирования, возможнос ния простейшего оборудо венного производства о

25

30

Формула изобр

Способ анализа воды н вируса гепатита А путем воды через колонку с сор дение элюции, очистки от и определения в элюате с вирусной активности при отличающийся целью повышения степени руса гепатита А и его уп качестве сорбента исполь лический гидрат окиси ал

45 ме гидраргиллита

Изучение эффективности десорбции вируса гепатита А с кристаллического гидрата окиси алюминия в зависимости от используемого буфера

35767

10

15

используя 0,05 глициновый буфер рН 1,5.

Злюаты с колонок объединяют и производят антимикробную обработку хлоро формом, концентрируют ультрафильтрацией до конечного объема 5 мл и анализируют на наличие специфической антигенной активности при помощи ИФА„ Антиген вируса гепатита А был определен в разведении 1:8, Кроме того, часть элюата после дополнительного освобождения от контаминирующей бактериальной флоры при помощи стерилизующей фильтрации была использована для заражения культуры клеток FrHK-4, После трек пассажей вирус гепатита А был обнаружен при помощи ИФА, Наличие вируса гепатита А подтвердили, используя 2Q непрямой иммунофлюоресцентный метод. Использование предложенного спосоЪа позволит увеличить степень выявления вируса гепатита А, которая не зависит от вида и степени загрязненности анализируемой воды по сравнению с известным способом, а также - значительно упростить анализ за счет исключения этапа низкоскоростного центрифугирования, возможности использования простейшего оборудования отечественного производства о

25

30

Формула изобретения

Способ анализа воды на содержание вируса гепатита А путем пропускания воды через колонку с сорбентом, проведение элюции, очистки от микрофлоры и определения в элюате специфической вирусной активности при помощи ИФА, отличающийся тем, что, с целью повышения степени выявления вируса гепатита А и его упрощения, в . качестве сорбента используют кристаллический гидрат окиси алюминия в форПримечание: объем элюата во всех случаях был одинаков и равнялся 5 мл„

Изобретение относится к эпидемиологии вирусного гепатита, в частности выделению вируса гепатита А из объектов окружающей среды, а именно из воды. Целью изобретения является повышение степени выявления вируса гепатита А в больших объемах воды разной степени загрязненности, упрощение и удешевление способа Для- этого адсорбцию вируса гепатита А из подкисленной соляной кислотой до уровнярН ,5 анализируемой пробыосуществляютн,-; кристаллическом гидрате окиси алюминия в форме гицраргиллита с последующей элюци- ей 0,05 М глицериновым буфером рН 11,5,нейтрализацией до уровня рН 7,0- 8,0, проведения антимикробной обработки хлороформом, концентрацию и анализ на наличие специфической антигенной активности при помощи ИФ. 1 табл. , 1 ил. с С

Ацсорбция вируса / % /

100

;о

20

6

10

рН