ДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА BIS ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Советский патент 1970 года по МПК C12P19/42 

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности.

Известны способы выделения витамина Bi2 из культуральной жидкости, полученной в результате культивирования его продуцентов метанового брожения путем гидролиза культуральной жидкости, адсорбции витамина из гидролизата иа колонке с катионитом в Н форме с последующей элюцией витамина с катионита водным раствором аммиака и аммиачно-боратным буфером и кристаллизацией его при помощи ацетона.

Для получения очищенного кристаллического витамина в результате удаления балластных веществ с помощью специально приготовленных форм сорбента щелочной и кислой хроматографической окиси аммония предложено элюат перед кристаллизацией обрабатывать сорбентом - щелочной окисью алюминия. Последний отделяют одним из известных способов, iHampiHiMep декантацией, промыванием водой, а полученный раствор вместе с ггромывньпми водами лодкисляют и обрабатывают кислой окисью алюминия с последующи.м иодщелачиванием и фильтрацией очищенного раствора от полученного осадка алюмината натрия. Очистку ведут в следующих условиях: рН щелочной окиси алюминия равен 10,0, начальный рП очищаемого раствора 8,0, а конечный 10,0, рП кислой окиси алюминия равен 3,0, начальный рН очищаемого раствора 2,5-3,0, а конечный 4,0.

Способ заключается в следующем.

КультуралЬную жидкость метанового брожения подвергают гидролизу, гидролизат пропускают через колонку с катионитом в П +-форме. С катионита витамин Bi2 элюируют водным раствором аммиака и аммиачно-боратным буфером. Полученные темно-окрашенные элюаты объединяют, доводят рН до 8,0 и обрабатывают щелочной окисью алюминия, имеющей рН 10,0; конечный рН очищаемого раствора должен быть 8,0-9,0. При этом достигается частичная очистка. Затем декантат и промывные воды подкисляют до рП 4,0 и обрабатывают кислой окисью алюминия, имеющей исходный рН 2,5-3,0. Конечный рН очищаемого раствора равен 4,0.

Раствор декантируют, сорбент нромывают водой с рН 4,0. Полученный раствор И1меет светло-розовую или желтовато-розовую окраску. Этот раствор подвергают цианированию с последующей экстракционной очисткой.

Пример. 600 л культуральной жидкости с известным содержанием витамина Bi2 (по пробирочному методу с Е. coli 113-3) гидролизуют с помощью специально разработанного способа. Выход на гидролизе 98,3%. Гидролизат пропускают через колонку с катиони.том СГ-1 в Н- --форме; после тщательного промывания колонки подкисленной водой витамин Bi2 элюируют с катионита водным раствором аммиака и аммиачно-боратным буфером.

Темно-коричневый щелочной элюат после доведения рН до 8,0 обрабатывают щелочной окисью алюминия в статических условиях, сорбент отделяют декантацией и промывают водой с рН 8,0. Полученный декантат и промывные воды подкисляют до рН 2,5-3,0 и обрабатывают кислой окисью алюминия в статических условиях, сорбент отделяют н промывают водой с рН 4,0. Очищенный желтоваторозовый раствор подщелачивают до рН 8,0. выпавщий осадок алюмината натрия отфильтровывают; выход на стадии 68,5% от исходного (по пробирочному методу с Е. соИ 113- 3). Прозрачный фильтрат обрабатывают цианистым калием.Цианированный раствор экстрагируют смесью фенол-четыреххлористый углерод (1 : 1,1 по объему), органическую фазу отделяют н после добавления 1,5 объема четыреххлористого углерода и 0,8 объема н-бутилового спирта витамин Bi2 (кобаламин) извлекают водой, водный экстракт промывают эфиром. Выход на стадии 69,3% от исходного в культуралыюй жидкости (по фотоколориметрическому анализу).

Затем водный экстракт сгущают в вакууме до небольшого объема. Полученный водный концентрат разбавляют четырьмя объемами ацетона, вынавщий осадок балластных веществ отделяют фильтрованием. Водно-ацетоновый экстракт подвергают хроматографированию на колонке, нанолненной окисью алюминия, обработанной ацетоном. После адсорбции кобаламинов на верхней части слоя сорбента колонку промывают 80%-ным водным раствором ацетона. Витамин BIS элюируют 50%-ным водным раствором ацетона, при этом начальная и конечная фракции, обогащенные другими кобаламинами, собирают отдельно. Из темно-красного элюата кольца витамин В12 кристаллизуют с помощью добавления большого количества ацетона. Выход сырь1х кристаллов составил 59,1% от содержания в исходной культуралъной жидкости. По данным электрофореза и хроматографии, на бумаге биологически активные формы составляют 93%, в том числе цианокобаламин 64%; снектр ноглощення раствора кристаллов имеет максимум при длине волн 278, 360, 548 т.«.

ч 9

1 71 1,/1

р- - о,/о

-.VIS

Предмет изобретения

1. Способ выделения витамина Bja из культуральной жидкости, полученной в результате культивирования его продуцентов метанового брожения путем гидролиза культуральной жидкости, адсорбции витамина из гидролизата на колонке с катнонитом П -форме с последующей элюцией витамина с катионита водным раствором аммиака и аммиачно-борат5 ным буфером и кристаллизации его при помощи ацетона, отличающийся тем, что, с целью получения очип1,енного кристаллического витамина в результате удаления балластных веществ, элюат перед кристаллизацией обрабатывают сорбентом - щелочной окисью алюминия, последний отделяют одним из известных снособов например декантацией, цромываннем водой, а полученный, раствор вместе с промывными водами нодкисляют и обрабатывают кислой окисью алюминия с последующим подп елачиванием и фильтрацией очиш.енного раствора от полученного осадка алюмината натрия.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что

0 при сильно загрязненных гидролизатах очистку производят в следующих условиях: рН щелочной окиси алюминия равен 10,0, началь1:ый рП очищаемого раствора 8,0, а конечный 10,0, рН кислой окиси алюминия равен 3,0,

начальный рН очищаемого раствора 2,5-3,0,. а конечный 4,0.