Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген С человека Советский патент 1992 года по МПК C12N15/12 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения зимогенных форм человечес- кого белка С.

Белок С - витамин К - зависимый плазменный белок играет важную роль при регулировании свертывания крови. Концентрация белка С является низкой при тромботических состояниях, таких как диссемилирующий внутрисосудистый тромбоз, и при заболеваниях, располагающих к тромбозу, таких как большая

10 20

5 -АТС TGG CAG СТС АСА AGC СТС СТО H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU

5

травма, крупное хирургическое вмешательство и рак.

Для облегчения понимания изобретения и активации белка С ниже представлена кодирующая последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность человеческого белка С Эта аминокислотная последовательность и ее соответствующие части характеризуют также нативный человеческий белок С для целей предлагаемого способа

3040

CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA АТТ LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE 1015

V|

CA О 09 СЯ

N

CO

Изобретение относится к биотех нологии и может быть использовано для получения зимогенных форм чело веческого белка С. Способ конструиро - вания рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген С человека, зак лючается в выделении фрагмента ДНК, кодирующего тяжелую цепь белка С человека с последующим осуществлением сайт специфического мутагенеза исубклониро- ванием фрагмента ДНК с мутацией в соответствующую плазмиду. При этом получают плазмиды, кодирующие поли пептид, включающий легкую цепь белка С человека, сигнальньй пептид и про пептид J1 карбоксшшрованного секре -1 тируемого белка, дипептид лизин арг- гинин, аргиниж-лизин или аргинин - аргинин и фрагмент ДНК, содержащий мутацию о 2 табл ,

50 60 70 8090

ТСС GGC АСА CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTCTCC AGC AGC GAG CGT

SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHESER SER SER GLU ARG

20 25 30

-1739854

100110 120 130 140

GCC CAC CAG GTGCTG CGGАТС CGC AAA CGT GCC AAC ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VALLEU ARGILE ARG LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU 35 40 45

150 - 160 170 180190

GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG АТС TGT GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS 505560

200 210220 230 240

GAC TTC GAG GAGGCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAC АСА CTG

ASP PHE GLU GLUALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU 65707580

250 260 270 280

GCC TTC TGG TCC AAG CACGTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC

ALA PHE TRP SER LYS HISVAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

8590 95

29Q 300 310 320 330 TTG GAG CAC CCG TGC.GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC АТС LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE 100105110

340 350 360 370 380

GAC GGC АТС GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGCGGCTGG GAG GGC

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SERGLYTRP GLU GLY

115120125

390400410420 430

CGC TTC TGC CAG CGCGAGGTG AGCTTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC

ARG PHE CYS GLN ARGGLUVAL SERPHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

130135140

440 450 460 470 480

GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGCСТА GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYSLEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145- 150155160

490 500 510 520

AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

165 170175

CCC GCA GTG AAG TTCCCT TGT GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG

PRO ALA VAL LYS PHEPRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS 180185190

580590 600 610 620

AAG CGC ACTCAC CTG AAA CGA GAC АСА GAA. GAC CAA- GAAGAC CAA GTA

LYS ARG SERHIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLUASP GLN VAL

195200 205

630640 650 660670

GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO 210215220

51739854

680 690 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA 225230235240

730 740 750760

GTG CTC АТС CAC CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC CAC TGC ATG GAT VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THE ALA ALA HIS CYS MET ASP

245250255

770 780 790 800 810

GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTTGGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEUGLY GLU TYR ASP LEU ARC ARC , 260 265 270

820830 840 850 860

TGG GAG AAG TGGGAG CTG GACCTG GACАТС AAG GAG GTC TTC GTC CAC

TRP GLU LYS TRPGLU LEU ASPLEU ASPILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

275280285

870 880 890 900 910 CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC АТС GCA CTG CTG CAC PRO ASN TYR SER LYS SEK THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS 290295300

920 930 940 950 960 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC АТС TGC CTC LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU 305310315320

970 980 990 1000

CCG GAC AGC GGC CTTGCA GAC CGC GAGCTC, AATCAG GCC GGC CAG GAG

PRO ASP SER GLY LEUALA GLU ARG GLULEU ASNGLN ALA GLY GLN CLU

325330335

1010 10201030 1040 1050

ACC CTC GTG ACG GGC TCGGGC TAC CACAGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC

THR LEU VAL THR GLY TRPGLY TYR HISSER SER ARG CLU LYS GLU ALA.

340345 350

1060 1070 1080 1090 ПОО AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC АТС AAG ATT CCC GTG GTC LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL 355360365

1110 1120 1130 1140 1150 CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC PRO HIS ASN GLU CYS SER GbU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370375380

116011701180 1190 1200

ATG CTG TGT GCG GGCАТС CTC GGGGAC CGG CAG GAT CCC TGC GAC GGC

MET LEU CYS ALA GLYILE LEU GLYASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

385 390395 400

121012201230 1240

GAC AGT GGG GGG CCCATG GTC GCCTCC TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTC ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

1250 1260 1270 1280 1290 GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR 420425430

1300 1310 1320 1330 1340 GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC CAC TGG АТС CAT GGG CAC GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS 435440445

1350 1360 1370 1380 АТС AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-3 CLE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH 450455460

ДНК-последовательность получена из к-ДНК-клонов, созданных из человеческой печеночной м-РНК, кодирующей человеческий белок С Два из этих к-ДНК-клонов используют для конструирования ДНК-молекулы, включающей в себя как последовательность, кодирующую белок С, так и части ДНК, кодирующие нетранслированную м-РНК на концах и 3 -кодирующего участка. Эту молекулу ДНК вводят в Pscl-сайт плаз- миды pBR322 для конструирования плаз- миды рНС7. Плазмида рНС7 включает описанную выше кодирующую последовательность, а также следующие дополнительные последовательности:

TGG AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG СТА ТСА TGG CGG CAG GGC GAA СТТ GCA СТА ТСТ CCA CGA CCC GCC ССТ АСА GGT GCC ACT GCC ТСС AGA-31

ге-pro - последовательность аминокислотных остатков 1-42, кодирующая сигнальный пептид и пропептид белка С человека, важный для направленной секреции и fr-карбо- ксилирования белка С:

LC - последовательность аминокислотных остатков 43-197 белка С составляет легкую цепь (LC) как двуцепочечного зимогена (образованного из одноцепочечного зимогена отщеплением KR- дипептида), так и активированных форм белка С}

KR - последовательность аминокислотных остатков 198 - 199 белка С человека; считается, что эти остатки отщепляются возможно в две стадии, включающие в себя сначала расщепление (по остаткам 197 - 198 или 199 - 200), а затем действие кар- боксипептидазы или амино-i пептидазы с образованием двуцепочечного белка С;

АР - последовательность аминокислотных остатков 200 - 211 белка С, включающая в себя пептид активации, отщепляемый от зимогенных

и

5 -CGA CCC ТСС CTG-CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG CAA TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC GCA G-3

r r

соответственно на концах 5 - и 5 - нити, кодирующей последовательности для выделившегося человеческого белка С В силу комплементарной природы пар оснований ДНК, последовательность одной нити двунитевой молекулы ДНК остаточна для определения последовательности второй нити. Плазмиду рНС7 выделяют из E.coli K12 RR 7/рНС7, депонированного под номером NRRL В-15926,

Белок С можно представить схема- тически следующим образом:

5

0

5

форм С с образованием активированного белка С; АНС - последовательность аминокислотных остатков 212 - 461 белка С, однократно пост-трансляционно модифицированного, составляет активированную тяжелую цепь (АНС) активного белка С; НС - тяжелая цепь двуцепочечной формы зимогена С, однократно пост-трансляционно модифицированного, состоит из аминокислотных остатков 0 200 - 461, АР и АНС„

Зимоген С является предшественни - ком сариновой протеаэы, синтезируемым в печени и присутствующим в крови. . Для проявления полной биологической 5 активности белок С требует посттрансляционных модификаций, для которых необходим витамин К. Двуцепо- чечный, связанный дисульфидным мостиком, зимоген С образуется из од- 0 ноцепочечного зимогена протеолизом Считается, что этот ограниченный протеолиз включает в себя отщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199. Активация двуцепочечного 5 зимогена включает в себя протеоли- тическое расщепление пептидной связи ARG-LEU (остатки 211 и 212). Это последнее расщепление освобождает декалептид (остатки 200 - 211), акти- вационный пептид, составляющий амино- окончание большей (тяжелой) цепи дву цепочечной молекулы зимогена. Белок С содержит около 23% углеводов. Белок С содержит также большое количество необычных аминокислот, включая J -кар- боксиглутаминовую кислоту и -окси- аспарагиновую кислоту,J1-к ар бок сиг лу- таминовая кислота (gla) образуется jf-глутамилкарбоксилированием из остатков глутаминовой кислоты с помощью микросомальной карбоксилазы.

Аминокислотные остатки в описываемых белках и пептидах имеют сокращения, приведенные в табл,

Т а б л и ц а

200 201 202 203 204 205 296 207 208 209 210 211 ASP-THR-GLU-ASP-GEN-GLU-ASP-GLN-VAL-ASP-PRO-ARG,

к

1

10

15

20

73985410

Описано несколько способов получения нативного зимогена человеческого белка С. Зимогенная форма человеческого белка С, полученная техно- , логиеи рекомбинантной ДНК, идентична зимогенным формам человеческого белка С, естественно присутствующим в человеческой крови, и активируется в теле лишь естественным путем, включающим тромбин-тромбомодулиновьй комплекс - В данном изобретении предлагаются зимогенные формы человеческого белка С, которые могут активироваться in vivo одним тромбином с клинически значительной скоростью. Кроме того, эти зимогенные формы легче подвергаются активации тромбин/бромбомоду- лином, чем нативный зимоген человеческого белка С

В изобретении предлагаются также рекомбинантные ДНК, которые кодируют пре-препептид, содержащий сигнальный пептид для направления секреции и

25 пропептид из У-карбоксилировэнного белка о

Рекомбинантные ДНК по. данному изобретению включает в себя также последовательность, кодирующую легкую цепь человеческого белка С, расположенную в трансляционной структуре считывания сразу за последовательностью, кодирующей пре-пропептид. Легкая цепь человеческого белка С содержит аминокислотные последовательности 43-197 белка С, Аминокон- цевые части витамин К-зависимых плазменных белков, такие как аминоконце- вая часть легкой цепи белка С, ответственны за связывающую кальций активность этих белков„

Рекомбинантные ДНК по данному изобретению включают в себя также последовательность, кодирующую дипеп- тид LGS-ARG (KR), расположенный в

45 трансляционной структуре считывания сразу за последовательностью, кодирующей легкую цепь. Дипептид LYS-ARG расположен на карбокси-концевом участке легкой цепи,

50 Зимогенные формы по данному изобретению отличаются от.нативных зимо- генных форм человеческого белка С, В нативном человеческом белке С . имеется следующий ахтивационный пеп55 тид:

30

35

40

где числа соответствуют положению водит к отщеплению аминокислотных аминокислотных остатков в белке С. В остатков 1 -42) с образованием зи- данном изобретении описывается замена могенной формы. Замена пролшювого остатка ASP в положении 209 на один остатка в положении 210 в выделившемся человеческом белке С на валин,

из следующих остатков: РНЕ, GLY, TYR или TRP, что приводит к соответствующей зимогенной форме, имеющей большую чувствительность к расщеплению одним тромбином, кроме повышенной чувствительности к расщеплению тром- бин-тромбомодулиновым комплексом

Другие замены аминокислот наряду с заменами в положении 209 могут

кроме одной из четырех описанных выше замен в положении 209, приводит к новому зимогену. Замена остатка IQ аспарагиновой кислоты в положении 214 белка С, наряду с одной из описанных выше замен в положении 209 и с заменой, описанной для положения 210, или без такой замены, на остатакже повышать чувствительность ре- j 5 ток аспарагина также приводит к полузультирующего зимогена к действию тромбина Выражение результирующий зимоген означает, что хотя замены описаны с указанием положения амичению нового зимогена„

Таким образом, предпочтительные новые зимогенные формы человеческого белка С образуются в результате секнокислотных остатков в выделившемся 20 Реции и обработки молекул выделившечеловеческом белке G, однако выделившийся человеческий белок С должен быть сначала секретирован (что приHfcN-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE

. SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

ALA HIS GLN VAL LEU ARC ILE ARC LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

GLU,LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

. ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GT.Y ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL R R2 ARG LEU ILE R3 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

кроме одной из четырех описанных выше замен в положении 209, приводит к новому зимогену. Замена остатка аспарагиновой кислоты в положении 214 белка С, наряду с одной из описанных выше замен в положении 209 и с заменой, описанной для положения 210, или без такой замены, на остачению нового зимогена„

Таким образом, предпочтительные новые зимогенные формы человеческого белка С образуются в результате секгося человеческог-о белка С со следующей аминокислотной последовательностью:

1

13 ASN TYR SER.

ALA GLN PRO ASP SER GLY LEU VAL THR ARC ASN ARC HIS ASN GLU LEU CYS ALA SER GLY GLY GLY LEU VAL VAL TYR THR ARC ASP LYS

.LYS SER ALA THR LEU ALA GLY TRP THR PHE CYS SER GLY-ILE PRO MET SER TRP LYS VAL GLU ALA

плазмиды pL APC

Аминокислотные последовательности, кодируемые в положениях 209, 210 и 214 в предпочтительных кодирующих последовательностях, представлены в табло2«

Таблица2

39854 THR ASP

SER GLN ARC GLU TYR HIS LEU ASN VAL MET GLY ASP ALA SER GLU GLY ARC TYR GLN LYS

14 ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU SER .SER ARC GLU LYS GLU ALA PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL SER ASN MET VAL SER GLU ASN ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS SER TRP ALA PRO-COO

Плазмида pLPC-167G является иллюстративным вектором экспрессии, в котором кодон аспарагиновой кислоты в положении 209 белка С заменен на ко- дон для глицина. Конструирование плазмиды pLPC-167G описано в примере 3. Существенно, что конструирование включает в себя сайт-специфичный мутагенез последовательности, кодирующей белок С. Часть последовательности, кодирующей белок С, вставляют в в фаг М13тр18 и изменяют сайт-специфичным мутагенезом. Подвергнутую мутагенезу кодирующую последовательность клонируют затем в эукариотном клонирующем векторе для получения плазмиды pLPC-167G, идентичной плаз

15

миде pLAPC, за исключением того, что , имеется вставка последовательности, | кодирующей активационный пептид, в . котором кодон для глицина заменен на кодон для аспарагиновой кислоты в положении 209.

В случае соединений по предлагаемому способу, где остаток аспарагиновой кислоты в положении 214 заменен на остаток аспарагина, производное белка С, получаемое при активации зимогенной формы, также является соединением по данному изобретению

ДНК по данному изобретению могут быть также синтезированы химически или соединением рестрикционных фрагментов, либо сочетанием способов, известных в данной области

Иллюстративные векторы по данному изобретению, плазмиды pLPC-167G и pLPC-1-67G содержат ВК-усилитель, стимулирующий транскрипцию аденовирусным основным поздним промотором Большое -число эукариотных промоторов, усилителей и векторов экспрессии известно в данной области и может быть использовано в предлагаемом способе. Эука- риотньй вектор экспрессии может также функционировать без усиливающего . элемента. Суть данного изобретения не связана с конкретным усилителем или промотором, используемым для стимуляции экспрессии зимогена белка С, а скорее определяется новой кодирующей последовательностью и соответствующими белками, получаемыми из такой последовательности,,

Однако выбор векторных элементов таких как промоторы, усилители и селективные маркеры, может оказать сильное влияние на максимальные концентрации белка, вырабатываемого клеткой-хозяиномс

Выбор клеток-хозяев зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого для экспрессии ДНК-соединений, кодирующих белков С. Поскольку белок С и производные белка С согласно предлагаемому способу подвергаются значительной пост-трансляционной модификации, то некоторые клетки-хозяева более предпочтительны для использования с векторами по данному изобретению. Известно, что

15

20

25

Jf-карбоксилированных белков, таких I как человеческий белок С. Одна та- кая трансформирования аденовирусом , линия клеток человеческой эмбриональной почки представляет собой ли нию клеток 293, доступную в АТСС по номером АТСС CRL 1573.

Однако преимущества при получени JQ У-карбоксилированного белка, такого как зимоген человеческого белка С в линии клеток, трансформированных ад новирусом, не ограничиваются чело- веческими почечными эмбриональными клетками, трансформированными адено вирусом Фактически, как правило, трансформированные аденовирусом кле ки являются отличными хозяевами для получения Jf-карбоксилированного человеческого белка С Одной из особенно предпочтительных клеточных линий этого типа является AV 12-664 (далее обозначается как AV 12) клеточная линия, доступная в АТСС под номером АТСС CRL 9595 Клеточная ли ния AV 12. получена инъекцией человеческого аденовируса 12 в шею сирийского хомяка и выделением клеток результирующей опухолио

Экспрессия кодирующих последовательностей человеческого белка С, содержащихся в векторах по данному изобретению, происходит в тех клетках-хозяевах, в которых промотор связан со структурными генными функциями

Векторы pSV 2-типа включают в себя сегменты генома SV 40, содержащего определенный эукариотный промотор единицу (ер), последовательность вве 40 дения (IVS) и полиаденомный (рА)

сайт. При отсутствии Т-антигена SV 4 плазмидные векторы pSV 2-типа трансформируют клетки-хозяева млекопитающих и другие эукариотные клетки интегрированием в хромосомную ДНК клеток-хозяев «

Вырожденность генетического кода позволяет заменить нуклеотиды в участках, кодирующих полипептид, а также в трансляционном стоп-сигнале без изменения последовательности, кодирующей полипептидо Такие последовательности могут быть выведены из известной аминокислотной или ДНК-пос

30

35

45

50

трансформированные аденовирусом чело- 55 ледовательности человеческого белка

С и могут быть сконструированы по обычным синтетическим или сайт-специ фичным мутагенным методикам.

веческие эмбриональные почечные клетки предпочтительны для использования при рекомбинантном получении

, |

15

20

25

73985416

Jf-карбоксилированных белков, таких I как человеческий белок С. Одна та- кая трансформирования аденовирусом , линия клеток человеческой эмбриональной почки представляет собой линию клеток 293, доступную в АТСС под номером АТСС CRL 1573.

Однако преимущества при получении JQ У-карбоксилированного белка, такого как зимоген человеческого белка С в линии клеток, трансформированных аденовирусом, не ограничиваются чело- , веческими почечными эмбриональными клетками, трансформированными аденовирусом Фактически, как правило, трансформированные аденовирусом клетки являются отличными хозяевами для получения Jf-карбоксилированного человеческого белка С Одной из особенно предпочтительных клеточных линий этого типа является AV 12-664 (далее обозначается как AV 12) клеточная линия, доступная в АТСС под номером АТСС CRL 9595 Клеточная линия AV 12. получена инъекцией человеческого аденовируса 12 в шею сирийского хомяка и выделением клеток результирующей опухолио

Экспрессия кодирующих последовательностей человеческого белка С, содержащихся в векторах по данному изобретению, происходит в тех клетках-хозяевах, в которых промотор связан со структурными генными функциями

Векторы pSV 2-типа включают в себя сегменты генома SV 40, содержащего определенный эукариотный промотор- единицу (ер), последовательность вве- 40 дения (IVS) и полиаденомный (рА)

сайт. При отсутствии Т-антигена SV 40 плазмидные векторы pSV 2-типа трансформируют клетки-хозяева млекопитающих и другие эукариотные клетки интегрированием в хромосомную ДНК клеток-хозяев «

Вырожденность генетического кода позволяет заменить нуклеотиды в участках, кодирующих полипептид, а также в трансляционном стоп-сигнале без изменения последовательности, кодирующей полипептидо Такие последовательности могут быть выведены из известной аминокислотной или ДНК-пос-

30

35

45

50

ледовательности человеческого белка

С и могут быть сконструированы по обычным синтетическим или сайт-специфичным мутагенным методикам.

17

Основным недостатком активированного белка С, как и любых активированных сериновых протеаз, является его короткое время полураспада (Т1/2) по сравнению с зимогенным предшественником. Причиной более короткого биологического полураспада активированных сериновых протеаз, включая активированный белок С, являются сложные процессы, вовлекающие клеточные и гуморальные механизмы. Активированные сериновые протеазы образуют также комплексы с ингибиторами сериновых протеаз, в норме присутствующими в плазме. Активированный белок С (АРС) комплексуется с АРС-ингибитором, а также с альфа-2-макроглобулином,, Неактивные зимогены, включая зимогены белка С по данному изобретению, не реагируют с ингибиторами сериновых протеаз.

Преимущество предлагаемых зимо- генов С заключается в том, что они лучше активируются тромбином, чем зимоген нативного белка, поскольку для активации зимогенов в присутстви Са отсутствует абсолютное требование комплексования тромбина с тром- бомодулиномо Это означает, что эти зимогены С после введения могут активироваться в местах внутрисосудис- того образования тромбина, в любых зонах развития внутрисосудистых тромбов. Таким образом эти рекомби- нантные зимогены белка С могут быть использованы как превентивные лекарства и будут при этом активироваться только в местах образования тромбов. Так как эти чувствительные к тромбину зимогены могут вводиться в зимогенной форме, то они не будут образовывать комплексы с ингибиторами белка С и будут обладать биологическим временем полураспада, равным таковому времени для зимогена нативного белка С.

Рекомбинантные зимогены белка С . по данному изобретению пригодны для предупреждения и лечения широкого спектра заболеваний, включая внутри- сосудистое свертывание, в том числе глубокий тромбоз вен, легочный эм болизм, периферийный артериальный тромбоз, эмболиэм, возникший в сердце и периферийных артериях, острый инфаркт миокарда, тромботические удары и диссеминирующий внутрисосу- дистый тромбоз.

и 73985418

По сравнению с активированным белком С дозы зимогенов белка С по данному изобретению из-за их уве- 5 (личенного Т1/2 могут быть значительно снижены при клиническом применении. При гомозиготном дефиците белка С доза зимогена белка С по данному изобретению находится в интервале Ю приблизительно 5 - 100 мг на одно лечение, а при гетерозиготном дефиците белка С - в интервале около 2,5 - 50 мг на лечение

Хорошим терапевтическим показа- 15 нием для активированного белка С является предотвращение глубокого тромбоза вен и легочного эмболизма,

Зимогены белка С по данному изобретению могут быть использованы при 20 лечении эмболии, происходящих от тромбов в периферийных артериях, преимущественно в каротидных артериях.

Зимогены по данному изобретению 25 пригодны также для лечения острых инфарктов миокарда. В острой фазе инфаркта миокарда эти зимогены можно вводить вместе с активатором тканевого плазминогена.

30

35

40

45

50

55

1

Пример 1,, Контсруированиеплаз- миды pLAPC.

А. Выделение ДНК-фрагмента, кодирующего пептид белка С.

Плазмида РНС7 содержит полную кодирующую последовательность белка С, 1 л L-бульона (10 г пептона, 10 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта), содержащего 15 мкг/мл тетрациклина, засевают культурой Escherichia coli К12 RR1/pHC7, инкубируют со встряхиванием при 37°С до достижения оптической плотности (О. U.) при 590 нм приблизительно 1 и прибавляют 150 мг хлорамфеникола Инкубирование продолжают 16 ч; добавление хлорамфеникола ингибирует синтез белка и дальнейшее деление клеток, но позволяет плазми- дам по-прежнему реплицироваться.

Культуру центрифугируют, суперна- тант отбрасывают, клеточную массу промывают 40 мл TES-буфера (10 мМ трис-НС1,рН 7,5; 10 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) и затем снова осаждают центрифугированием, Супернатант отбрасывают, клеточную массу замораживают в бане сухой лед - этанол и оттаивают. Оттаявшую клеточную массу ресуспендируют в 10 мл раствора

25% сахарозы 50 мМ ЭДТА, прибавляют 1 мл 5 мг/мг раствора лизоцима; 3 мл 0,25 М ЭДТА, рН 3,0 и 100 мкл 10 мг/ /мл РНК-азы А и проводят инкубирование во льду в течение 15 мин 3 мл лизи- рующего раствора (3 мл 10% тритон-Х 100; 75 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0; 15 мл 1 М трис-HCl и 7 мл воды) прибавляют к обработанным лизоцимом клеткам, перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин„ Клетки замораживают в бане сухой лед - этанол, оттаивают, центрифугируют в градиенте хлористого цезия. Выделяют плазмидную полосу, наблюдаемую в УФ-свете Плазмид-ДНК экстрагируют„

1 мг ДНК плазмиды рНС7 суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HClt рН 7,6 и 0,1 мМЭДТА) и хранят при - 20°С.

7 мкг ДНК плазмиды рНС7 гидроли- зуют ферментом Sst 1, а затем реет- риктазой Sal 1„ Sst I - Sal I фрагмент экстрагируют сначала фенолом, затем хлороформом, собирают осаждением этанолом, центрифугируют и суспендируют в 15 мкл ТЕ/10-буфера (10 мМ трис-основания, рН 7,6 и 0,1 мМ ЭДТА).

Смесь подвергают электрофорезу в О,6% агарозном геле с низкой температурой гелеобразования 2 - 3 ч приблизительно при 130 В и 65 мА в трис-ацетатном буфере Гель окрашивают в растворе этидий бромида и полосу ДНК, составляющую около 0,7 ТоП.Оо, вьцэезают из геля в виде маленького сегмента. Сегмент расплавляют инкубированием при 72°С.ХВ объеме около 400 мкл получают приблизительно 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Ssc I - Sal I плазмиды рНС7 длиной около 0,7 т.ПоО. Дополнительную очистку ДНК проводят пропусканием раствора ДНК через колонку NaCS-pre рас (BRL) в соответствии с инструкцией. Очищенный фрагмент ресуспенди- руют в 15 мкл деионизированной водыс

В. Конструирование рекомбинантно- го фага и удаление ДНК, кодирующей активационный пептид, сайт-специфичным мутагенезом

Около 1 мкг репликативной формы (RF) ДНК фага М13 m P18 обрабатывают рестриктазами Sst I и Sal 1„ Два фрагмента, получившиеся в результате расщепления, разделяют в 0,6% геле из агазорьа с низкой температурой гё5

5

леобразования, больший фрагмент вырезают из геля и очищают.

О,1 мкг Sst I - Sal I фрагмента

плазмиды рНС7-длиной около 0,7 т.п«о0 лигируют с 5 мкл Sst I - Sal I - обработанной М13 m p18 RZ ДНК в 2 мкл ЮХ-лигазного буфера, (0,5 М трис-HCl, рН 7,8; 60,8 мМ rfgCl ; 0,3 М дитиот

реитол /DTT/), 2 мкл 1 мг/мл BSA ,

1мкл 25 мМ АТР, 1 мкл (около 400 ед.) Т4-ДНК-лигаэы (NEB) и 2 мкл воды.

Около 300 мкл культивированной в течение ночи культуры E.coli K12 Ml01 используют для засевания 30 мл 2Х-ТУ-бульона (TY-бульон - это 10 г/л триптона, 10 г/л NaCl и 5 г/л дрожжевого экстракта) и результирующую культуру инкубируют при 37 С и аэрировании до достижения OoD,00 около 0,5, Культуру 10 мин охлаждают на ледяной бане, собирают центрифугированием и снова суспендируют в 15 мл холодного 10 мМ NaCl. Клетки снова собирают центрифугированием и суспендируют в 15 мл холодного 30 мМ CaCl-j 200 мкл клеток отделяют, добавляют к 9 мкл полученной выше ли- гированной ДНК и инкубируют на льду 0 приблизительно 30 мин. Затем ДНК-клеточную смесь инкубируют при 42°С

2мин и прибавляют к 3 мл топ-агара (TY-бульон с 0,5% агара, поддерживаемого в виде расплава при 45°С), содержащего также 50 мкл 2% X-Gal (X-Gal это 5-бром-5-хлор-3-индолил-/3- D-галактопиранозид), 50 мкл 100 мМ ,IPTG (IPTG - это изопропил- г-В-тио- галактопиранозид) и 100 мкл E.coli К12 Ш101 в логарифмической фазе роста. Затем смесь топ-агар/клетки помещают на TY-агаровые пластинки и инкубируют пластинки ночь при 37 С.

На следующее утро четыре явные 5 колонии раздельно используют для засева 2 мл 2Х TY-бульона и результирующие культуры инкубируют при 37°С и аэрировании 6 ч„ Затем культуры центрифугируют и 500 мкл результирую- 0 щего супернатанта (клеточную массу используют для получения фаговой ДНК для анализа с помощью рестриктаз) прибавляют к 500 мкл культуры (O.D.55Q - 0,5) E.coli K12 Ц1101 и . 50 мл 2Х TY-бульона. Эти культуры инкубируют ночь при 37°С, KF ДНК фага выделяют из клеточной массы по упрощенной методике по примеру 1А без антибиотика в культуральной среде и

5

0

21

стадии ультрацентрифугирования заменяют экстракциями фенолом и хлороформом. Трансформанты содержащие ДНК фага М13 m p18-HEI, идентифицируют рестрикционным ферментным анализом их фаговой ДНК.

После ночи культуры центрифугируют и к 5 мл супернатанта прибавляют около 1 мл раствора, содержащего 20 % полиэтиленгликоля (PEG) 6000 и 2,5 мМ NaCl, и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугируют, результирующий осадок, содержащий однонитевую ДНК фага М13 m р18-ПЕ1, снова суспендируют в 500 мкл TES-буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 0,1 МЭДТА; 10 мМ Nad) Раствор ДНК

57-GGGCAGTCACCTGAAACCACTGATTGATGGGAACATGA-3V

30 пмоль этого фрагмента индивидуально обрабатывают 5 ед Т4-полинуклео- тидкиназы в 10 мкл IX-киназного буфера (100 мМ трис-HCl, рН 8,3, 10 мМ DDT; 100 мМ MgClg.), содержащего 1 мкл 1 мМ АТР, 30 мин при 37°С и затем инкубируют 10 мин при 65°С и замораживают. Обработанные киназой ДНК используют для описываемого ниже мутагенеза.

На первой стадии мутагенеза мутагенный олигонуклеотид и универсальный праймер М13 ренатурируют в однонитевую фаговую ДНК Ренатурирование .проводят, прибавляя 300 нг (0,5 мкл) од- нонитевого фага M13mp18-HEI к 1 пмоль (1,2 мкл) универсального праймера, 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олиго- нуклеотида, 2 мкл 1ОХ-ренатурационно- го буфера (100 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА и 500 мМ NaCl) и 16 мкл воды, инкубируют смесь при 80° С 2 мин и затем 5 мин при 50° Сf затем дают смеси остыть до комнатной температуры.

После ренатурации олигонуклеоти- дов фаговую ДНК делают двунитевой, расширяя праймеры ДНК-полимеразой, Эту реакцию проводят, прибавляя 3 мкл 1ОХ расширяющего буфера (500 мМ трис-HCl, рН 8; 1 мМ ЭДТА и 120 мМ MgCl ) 3 мкл 10 Х-лигазного буфера; 1,5 мкл 0,2 мМ DTT; 3 мкл dNTP-снеси (0,5 мМ каждой dNTP); 1,2 мкл 25 мМ АТР; 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед/ /мкл, ВМВ); 1 мкл Т4-ДНК-лигазы (400 едо, NEB) и 19,8 мкл воды к смет си ренатурированной ДНК, Расширение

985422

экстрагируют сначала хлороформом, згН тем дважды ТЕ-насыщенным фенолом и затем снова хлороформом, Однонитевую ДНК осаждают с помощью NaOAc и этанола, центрифугируют, промывают 70%- ным этанолом.

Осадок высушивают и растворяют в 80 мкл водыо Этот образец фага ис- 10 пользуют на следующей стадии сайт- специфичного мутагенеза для удаления ДНК, кодирующей активационньй пептид.

Фмагмент однонитевой ДНК, исполь- зуемый для мутагенеза при удалении ДНК, кодирующей активационньй пептид, получают на автоматическом ДНК-синтезаторе в следующем виде:

проводят инкубированием при комнатной температуре в течение 30 мин, затем 4 ч при 37°С и в течение ночи при 4С.

Реакцию останавливают экстракцией фенол-хлороформом и ДНК осаждают этанолом с ацетатом натрия (NaOAc)„ ДНК собирают центрифугированием, суспен- дируют в 40 мкл Si-буфера (0,3 М NaCl:; 0,03 M NaOAc, рН 4,5 и 0,3 мМ ZnCl2) и прибавляют к раствору ДНК, Установлено, что Si-обработка не обладает существенными, преимуществами и в методиках конструирования, описываемых в последующих примерах, Si-обработка полностью исключена.

Раствор ДНК разделяют в две пробирки на две равные части и в одну из пробирок прибавляют 100 ед. (ВМВ) SI-нуклеазы, Si-реакцию проводят инкубированием 5 мин при комнатной температуре и останавливают экстрагированием реакционной смеси ТЕ-на- сыщенной смесью фенол-хлороформ (50:50).

Осадок ДНК суспендируют в 60 мкл воды и трансформируют в E.coli K12 IM101 о.Мутантов отбирают с помощью радиоактивно меченного мутагенного олигонуклеотида, AAACGACTCA- TTGA-3 и точечных гибридизаций, . Несколько положительно гибридизиро ванных пятен отбирают и высевают в 2 мл культуры E,coli K12 IM101, находящейся в логарифмической стадии роста. Культуры инкубируют при 37 С и аэрировании около 6 ч и затем используют для получения однонитевой ДНК.

Однонитевую ДНК секвентируют. Несколько фагов идентифицируют цепе- вой мутацией. Фаг, в котором удалена последовательность, кодирующая ак- тивационный пептид, это целевой фаг М13 mpia-HE2. Мутация в фаге М13 гар18-НЕ2 вызывает уменьшение размера на 36 пар оснований по сравнению с природной кодирующей последовательностью и эту разницу можно использовать для идентификации ДНК, содержащей мутировавший участок. RF-форму фага М13 тр18-НЕ2.получают последующим конструированием.

С. Конструирование штазмиды pLAPC из фага М13 тр18-НЕ2 и плазмиды pLPC

Sst I - Sal I фрагмент (около 0,7 т„п„о,) KF-формы фага М13 тр18-НЕ отрезают от фага и выделяют по методике примера 1А„

Три ДНК-фрагмента связывают вместе с получением плазмиды pLAPC: Sst I - Sal I фрагмент фага М13 mp18-HE2 (около 0,7 т.п.о.) и 2 ДНК-фрагмента плазмиды pLPCo Поскольку в плазмице pLPC находятся сайты рестриктаз Sal Sst I и Eco RI, то целевые рестрик- ционные фрагменты Eco RI - Sal I и Eco RI - Sst I нужно получать двумя отдельными расщеплениями.

Sst I - Eco RI расщепленную ДНК суспендируют в воде и помещают в 0,6% гель из агарозы с низкой темпе- ратурой гелеобразования для отделе- ния ДНК-фрагментов.

Для получения EcoR I - Sal I- фрагмента около 15 мкг плазмиды pLPC сначала обрабатывают рестрикционным ферментом Ара для удаления загрязнений близкими по размерам:, рестрик- ционными фрагментами. Затем рестрик- тазы Sal I, EcoR I добавляют к раствору Apal-расщепленной ДНК плазмиды pLPC и результирующую смесь инкубируют.. I-EcoR I расщепленную ДНК плазмиды pLPC сначала экстрагируют фенолом, затем хлороформом,

-

собирают осаждением этанолом и цент рифугированием. Суспендируют в воде,( помещают в 0,6% агарозяый гель и разделяют электрофорезом.

Рестрикционные фрагменты EcoR I - Sal I (около 3,76 т.п.о.) и EcoR I - Sst 1„(около 2,0 т.п.о.) вырезают из геля и выделяют./

-

. JQ jg

20 2 25 ,

35

40

45

( /

50

55

Каждый из двух очищенных рестрик- ционных фрагментов прибавляют к Sst I - Sal 1-рестрикционного фрагмента (около 0,7 т.п.о) фага М13 тр18-НЕ2 и лигируют, получая в результате целевую плазмиду pLAPC. Ппазмида pLAPC отличается от плазмиды pLPC отсутствием ДНК, кодирующей активационный пептид.

Плазмиду pLAPC трансформируют в E.coli K12 RV308 и выращивают.

Трансформанты Ее соli K12 RV308/ /pLAPC подтверждают рестрикционным ферментным анализом. Плазмидную ДНК получают из трансформантов E.coli К12 RV308/PLAPC практически так же, как в примере 1А, за исключением того, что в качестве селективного агента используют 50 мкг/мл ампициллина, а не тетрациклина.

П р и м е р 2. Конструирование плазмиды pLPC.

Плазмиду pLPC используют как промежуточный вектор при конструировании плазмиды pLAPCo Плазмида pLPC содержит сегмент ДНК, кодирующий ВК-вирус- ный усилитель и поздний промотор аденовируса 2, ведущие экспрессию человеческого белка С. Конструирование плазмиды pLAPC в основном приводит к замене последовательности, кодирующей человеческий белок С в плазмиде pLPC, на другую последовательность кодирующую белок С, на которой удалена ДНК, кодирующая активационный пептид.

В примере 2В описано конструирование плазмиды рВК пео1, получаемой вставкой ВК-усилителя в плазмиду pdBPV-MMT neo. В примере 2С описано конструирование плазмиды pLPcat, получаемой вставкой позднего промотора аденовируса 2 в плазмиду pSV2cat. ч примере 2F описано конструирование плазмиды pBLcat, содержащей ВК-уси- литель для повышения активности позднего аденовирусного промотора. В примере 2Е описано конструирование плазмиды рЫЗЗ, вектора экспрессии белка С, начиная с исходной плазмиды рНС7 через конструирование промежуточной плазмиды pSV2-HPC8 и результирующее конструирование промежуточной плазмиды pLPC,.содержащей контролирующую экспрессию последовательность ВК-усилитель (аденовирусный поздний промотор плазмиды pBLcat, вставленную в плазмиду рЫЗЗ для управления экспрессией человеческого белка С),

A.Получение ВК-вирусной ДНК. ВК-вирус получают из Коллекции

Культур Американского Типа, номер АТСС VR-837. Организмом-хозяином для получения ВК-вирусной ДНК является культура клеток человеческой эмбриональной почки (РНЕК).

Вирус выделяют из клеток тремя циклами замораживания-оттаивания и клеточные остатки удаляют центрифугированием Вирус осаждают, собирают добавлением- ПЭГ - 6000, инкубируют 24 ч при 4°С и центрифугируют о Осадок растворяют в 0,1 X SSC-буфере (1Х SSC 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрат натрия, рН 7) при 1/100 первоначального объема. Вирусную суспензию центрифугируют, при этом наблюдают две полосы. Нижнюю полосу, содержащую полный вирион, собирают и обессоливают на колонке с сефадексом С-50

Додецилсульфат натрия прибавляют к раствору очищенных вирионов, полученных после колонки, до конечной концентрации 1%; прибавляют протеазу в концентрации 100 мкг/мл и раствор инкубируют 2 ч при 37 С. Затем к раствору прибавляют хлорид цезия до плотности 1,56 г/мл и этидий бромид до концентрации 100 мкг/мл° Раствор центрифугируют. После центрифугирования полосу вирусной ДНК выделяют и 5 раз экстрагируют изоамиловым спиртом, насыщенным 100 мМ трис-НС1, рН 7,8о Затем раствор ВК-вирусной ДН диализуют против ТЕ-буфера до достижения отношения поглощения ДНК при 260 нм/280 нм, равного 1,75 - 1,90 ДНК осаждают, доводя концентрацию NaCl до 0,15 М, добавляют 2 объема этанола, инкубируют раствор не менее 2 ч при -70 С и центрифугируют 10 ми при 12000 g. Результирующий осадок ВК-вирусной ДНК суспендируют в ТЕ- буфере в концентрации 1 мг/мл.

B.Конструирование плазмиды рВК neol.

Клетки E.coli K12 HB101/pdBPV - 11МТ пео получают в лиофилизованной форме из Коллекции Культур Американского Типа под номером АТСС 37224„ Лиофюшзованные клетки помещают на L-агаровые пластинки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°С с получением изолятов единичной колонии.

0

5

0

5

1 л L-бульона, содержащего 50 мкг/ /мл ампициллина, засевают колонией E.coli K12 HBlOI/pdBPV-NMT neo и инкубируют при 37 С до достижения OoD.5g0 равной приблизительно 1 г„ К культуре прибавляют 150 мг хлорам- фениколао Инкубирование продолжают приблизительно 16 ч; добавка хлорам- феникола ингибирует синтез белка и дальнейшее деление клеток, но позволяет продолжаться репликации плаз- мид. Из культуры получают плазмидную ДНК pdBPV-MMT neo по методике, описанной в примере 1А.

ДНК плазмиды pdBPV-MMT neo расщепляют рестриктазойс ВатН1„ ВатН1 - ВатН1 фрагмент ДНК осаждают, собирают центрифугированием и суспендируют о

ВатШ - ВатНЧ фрагмент плаэмиды pdBPV - ММТ пео (1 мкл) и ВагаН1 - ВатН1 фрагмент ВК-вирусной ДНК лиги- руют Т4-ДНК лигазой.Лигированную ДНК трансформируют в клетки E.coli К12 НВ101.

Трансформированные клетки помещают на L-агаровые пластинки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты Eocoli K12 НВ101/рВКпео1 и E.coli К12/рВК пео2 идентифицируют рестрик- ционным ферментным анализом

С оКонструирование плазмиды pLPcat, промежуточной плазмиды для конструирования плазмиды pBLcat.

Вирионная ДНК аденовируса 2 (Ad2) является двунитевой линейной молекулой длиной около 35,94 т«,п0о Поздний промотор Ad2 можно выделить в рест- рикционном фрагменте AccI - Pwu II,, (около 0,32 Ton.oJ генома Ad2; этот рестрикционный фрагмент соответствует последовательности между нуклеотида- ми Ь755 и 6071 генома Ad2, для его выделения ДНК Ad2 сначала рас- 5 щепляют рестриктазой Bal I ri вьщеляют Bal I - рестрикционный фрагмент длиной около 2,4 .Оо, содержащий всю последовательность AccI - Pvu II рестрикционного фрагмента длиной око- 0 ло 0,32т.п.о. Затем рестрикционный фрагмент Bal I длиной .около 2,4 ТоП„о. расщепляют AccI Pvu II с получением целевого фрагмента

ДНК Ad2 (полученной от BRL) обрабатывают рестриктазой Bal I, подвергают электрофорезу до разделения , рестрикцийиных фрагментов,

Bal I - рестрикционный фрагмент Ad2 длиной около 2,4 т.п.о, расщеп0

5

0

5

ляют вначале рестриктазой Accl, затем рестриктазой Pvu II, наносят на 6%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до отделения Accl - Pvu II - рестрикционного фрагмента длиной около 0,32 т„п.о, содержащего пйздний промотор Ad2.

Для превращения Accl - Pvu II рестрикционного фрагмента в Accl - Bel I - рестрикционный фрагмент Bel I - линкеры связывают с рестрик ционным фрагментом Accl - Pvu II длиной около 0,32 ТсП.о„ Поскольку , Bel I-линкеры имеют тупые концы, то они присоединяются только к Pvu II- окончаниям рестрикционных фрагментов Линкеры Bel I имеют следующую последовательность :

5 -CTGATCAG-3

3 -GACTAGTC-5 о

0,25 мкг обработанных киназой Bel I-линкеров прибавляют к раствору Accl - Bvu II-рестрикционного фрагмента длиной около 0,32 т„п„о,, затем добавляют 1000 ед„ Т4-ДНК-лигазы и 1 мкл 10Х лигазного буфера и результирующую смесь инкубируют ночь при 16°С. Линкеры Bel I могут связываться только с Pvu II-концом рестриционного фрагмента AccI-Pwu II. Последующее ДНК-секвентирование показывают, что 4 Bel I-линкера присоединены к Pvu II-концу рестрикционного фрагмента AccI-Pvu Но Эти дополнительные Bel I-линкеры можно удалить Bel I-отщеплением и повторным связыванием; однако дополнительные Bel I- линкеры не удаляют, поскольку они не мешают правильному функционированию векторов, содержащих эти линкеры

Клетки Eocoli R12 НВ101/pSV2cat получают в лиофилизованной форме от АТСС под номером АТСС 37155, и плаз- мидную ДНК pSV2cat выделяют. ДНК плазмиды pSV2cat лигируют вначале рестриктазой Асе I, а затем рестриктазой Stu I.

Accl - Stu I фрагмент ДНК плазмиды pSVcat смешивают с Accl - Pv« II фрагментом Ad2 имеющим присоединенные Bel I-линкеры, лигируют и трансфор мнруют в Eocoli K12 НВ101. Связанная ДНК является целевой плаэмидой pLPcat, содержащей поздний промотор Ad2, расположенный так, чтобы управлять транскрипцией и экспрессией хлорамфениколацетилтрансферазного гена.

D. Конструирование плазмиды pBLcat.

ДНК плазмиды рВК пуо расщепляют ферментом Accl и с помощью агарозного геля выделяют фрагмент длиной около 1,4 ТоПоО., содержащий ВК-усилитель„ 5 мкг фрагмента расщепляют рестриктазой Pvu II Фрагмент Pvu II ДНК Q выделяют, очищают и подготавливают к связыванию.

ДНК плазмиды pLPcat гидролизуют вначале рестриктазой Accl, а затем рестриктазой Stuff, ДНК плазмиды pLPcat несколько раз осаждают этанолом для очистки Accl - Stu I-рест- рикционного фрагмента длиной около 4,81 ТсПоО., содержащего E.coli - источник репликации и поздний промо- 0 тор Ad2.

Accl - Stu I - фрагмент плазмиды pLPcat лигируют с Accl т Pvu II- фрагментом (1,28 т.п.о.) плазмиды рВК neol. Связанная ДНК составляет 5 целевую плазмиду pBLcat,

Связанную ДНК используют для трансформирования клеток Е„соЦ К12 НВ101. Трансформанты E.coli K12 НВ101/ /pBLcat идентифицируют рестрикционным анализом

Е. Конструирование плазмиды рЫЗЗ„ Плазмида рЫЗЗ представляет собой вектор экспрессии человеческого белка С.

5,0 мкг дНК плазмиды рНС/ смеши- 5 вают с 50 ед0 рестриктазы Ban I, 10 мкл 10Х Ban I - реакционного буфера (1,5 М NaCl; 60 мМ трис-НС1, рН 7,9; 60 мМ МсС12 и 1 мг/мл BSA), 35 мкл воды и инкубируют, Расщеплен- 0 ную ДНК плазмиды рНС7 подвергают

электрофорезу в 3,5% полнакриламидном геле.

Из геля вырезают участок, содер- жащий Ban I - рестрикционный фрагмент длиной около 1,25 т.п,0о, поме0

щают в испытательную пробирку и измельчают. 1 мл экстракционного фера (500 мМ ШНОАс, 10 мМ MgOAc,

1 мМ ЭДТА, 1% SDS и 10 мг/мл т-РНК) добавляют к частицам и пробирку выдерживают ночь при 37°С„ Остатки удаляют центрифугированием и супер- натант переносят в новую пробирку. Супернатант пропускают через стекловату, прибавляют 2 объема этанола и смешивают. Результирующий раствор помещают на 10 мин в сухой лед - эта29

пол и ДНК осаждают центрифугированием.

Очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хранят при -20°С. Рестрикционный фрагмент Ban 1 модифицируют добавлением линкера для конструирования плаэмиды pSV2-HPC8

Необходимый линкер имеет следующую структуру:

5 -AGCTTTGATCAG- З1

3 -AACTAGTCCACG-5

8 мкг Ban I-фрагмента длиной около 1,25 т.п.о. добавляют и смешивают с 500 пмоль линкера и лигируют0

ДНК выделяют и растворяют в Ара реакционного буфера и гидролизуют рестриктазой Apal. ДНК осаждают Осадок ДНК растворяют и гидролизуют рестриктазой Hind III. Hind III - - Apal - рестрикционный фрагмент выделяют с помощью электрофореза в геле, 5 мкг целевого фрагмента суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хранят при -20°С.

ДНК плазмиды рНС7 гидролизуют рестриктазой Psc I буфера (1,0 М NaCl; 100 м М трис-HCl, рН 7,5; 1.00 мМ MgCl2 и 1 мг/мл BSA) и 35 мкл воды и инкубируют 2 ч при 37°С, подвергают электрофорезу в 3,5%-ном по- лиакриламидном геле, целевой фрагмен длиной около 0,88 тиПоО„, очищают, суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хранят при -20°С

5 мкг Pst I-фрагмента длиной около 0,88 т.п.Оо смешивают с 50 мкл следующего линкера, который конструируют на автоматическом ДНК-синтезаторе :

5 -GTGATCAA-3

S -ACGTCACTAGTTCTAG-S ,

Смесь лигируют с помощью Т4-ДНК- лигазы.

ДНК осаждают, растворяют и гидролизуют вначале рестриктазой Apal, а затем рестриктазой Bgl II, наносят на 3,5%-ный полиакриламидный гель и целевой рестрикционный фрагмент Apal Bgl Ц длиной около 0,19 ТоПоО выделяют.

ДНК плазмиды pSV2gpt (ATCC 37145) гидролизуют вначале рестриктазой Hind III, а затем рестриктазой Bgl 11 После расщепления Bgl II реакционную смесь наносят на 1%-ный агарозный гель и фрагменты разделяют электрофо резом. Гель окрашивают этидий бромидом, полосу, соответствующую целевом

w

to

15

20

25

фрагменту Hind III - Bgl II длиной около 5,1 т.п.Оо, вырезают из геля и помещают в диализную пробирку и электрофорез продолжают до выхода ДНК из агарозы. Буфер, содержащий ДНК из диализной пробирки, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК,Осадок суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и получают приблизительно 5 мкг целевого рестрикцион- ного фрагмента Hind III - Bgl II плазмиды pSV2gpt длиной около 5,1

Т.П.Оо

Hind III - Ара I фрагмент длиной 1,23 т.п,о., Ара I - Bgl II фрагмент длиной 0,19 ТоП.о. и Hind III - Bgl II фрагмент смешивают и лигируют„ Полученная ДНК является целевой плазмидой PSV2-HPC8.

Клетки E.coli K12 RRI (NRKL В-15210) трансформируют лигазной смесью и помещают на L- агаровые пластинки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Затем пластинки инкубируют при 37°С. Наличие трансформантов E0coli К12 RRI/pSV 2-HPC8 подтверждают рест- рикционным ферментным анализом,

50 мкг плазмиды pSV 2-HPC8 гидролизуют вначале рестриктазой Hind III, а затем рестриктазой Sal I0 Смесь наносят на 3,5%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до отделения целевого рестрикционного фрагмента Hind III - Sal I длиной около 0,29 ТоПоОо

ДНК плазмиды pSV 2-HPC8 гидролизуют вначале рестриктазой Bgl II, а затем рестриктазой Sal 1„ Смесь наносят на 3,5% полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до отделения целевого рестрикционного фрагмента Sal I - Bgl II длиной около 1,15 ТоП.о,

ДНК плазмиды р5Ґ2-Ј-глобин (NRRL В15928) гидролизуют рестриктазами Hind III и Bgl 11„ После расщепления реакционную смесь наносят на 1%-ный агарозный гель и фрагменты разделяют 50 электрофорезом. Из геля выделяют це30

35

40

4S

левой рестрикционный фрагмент Hind III - Bgl II.

Hind III - Sal I фрагмент плазмиды pSV 2-HPC8, длиной около 0,29 т.п0о,, Sal I - Bgl II фрагмент плаз- 55 миды pSV 2-HPC8 длиной около 1,15 т.п00о и 2 мкл Hind III - Bgl II фрагмента плаэмиды pSV 2-й-глобин лигируют Т4-ДНК -лигазой. Связанная

ДНК является целевой плазмидой рЫЗЗ Связанную ДНК используют для трансформирования Е„со11 К12 RRI и целевые трансформанты E.coli K12 RRI/ /рЫЗЗ идентифицируют по их ампициллин-устойчивому фенотипу и с помощью рестрикционного анализа0

F. Конструирование плазмиды pLPC из плазмид рЫЗЗ и pBLcat.

ДНК плазмиды pBLcat гидролизуют рестриктазой Hind III, отделяют в агарозном геле фрагмент длиной около 0,87 ТоП.о,, содержащий ВК-усшштель и поздний промотор Ad2.

ДНК плазмиды рЫЗЗ гидролизуют рестриктазой Hind III, смесь инкубируют 2 ч при 37аС, Затем ДНК разбавляют до 100 мкл, обрабатывают 0,06 ед телячьей кишечной щелочной фос- фатазы, дважды -экстрагируют фенолом и один раз хлороформом, осаждают этанолом и снова суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера о

Hind III фрагмент (длиной около 0,87 .о.) плазмиды PBLcat прибавляют к. Hind III- обработанной плазмиды рЫЗЗ и лигируют. Связанная ДНК составляет целевую плазмиду

5 -GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTCATTGATG-3

Мутагевизированный фаг, полученный сайт-специфичным мутагенезом, назван М13 тр18-НЕ4„

Конструирование плазмиды pLPC - 167 G проводят аналогично конструированию плазмиды pLAPC, описанному в примере 1Cо Однако плазмиду pLAPC конструируют с использованием двух рестрикционных фрагментов из плазмиды pLPC. При конструировании плазмиды pLPC - 167G эти же фрагменты получают из плазмиды pLAPC Причиной использования плазмиды pLAPC в качестве ,источника фрагментов вместо плазмиды pLPC является облегчение рестрикционного анализа при идентификации трансформантных плазмид pLPC - 167G. Так как плазмиды pLPC и pLPC - 167 G очень близки по размерам, то трудно различить плазмиду pLPC от плазмиды pLPC - 167С„

Однако.поскольку плазмида pLAPC меньше, чем плазмида pLPC - 167G, то, получая два фрагмента из плазмиды pLAPC, можно легко отличить родителя (плазмиду pLAPC) от целевой плазмиды pLPC 167G. Таким образом,

Связанную ДНК используют для трансформирования EoCdli K12 НВ101, Трансформированные клетки помещают на L-агаровые пластинки, содержащие ампициллин, и ДНК устойчивых к ампициллину трансформантов проверяют рестрикционным анализом Рестрикцион- ный фрагмент Hind III длиной около 0,87 т„ПоО„, кодирующий ВК-усили- тель и поздний промотор Ad2, может встроиться в Hind III - расщепленную плазмиду pL133 в одной из двух ориентации, лишь одна из которых дает плазмиду pLPCo

Приме рЗ„ Конструирование плазмиды pLPC-167 Go

Плазмиду pLPC-167 G конструируют в соответствии с сайт-специфичным мутагенезом и другими методиками, использованными при конструировании плазмиды pLAPC, как это описано в примере 1.

5

При конструировании плазмиды pLPC - 167G фаг М13 mp18-IIE1 (см. пример 1В) подвергают сайт-специфичному мутагенезу с помощью следующего мутагевизирующего олигонуклеотида:

при конструировании плазмиды pLPC - 167G рестрикционный фрагмент Sst I Sal I длиной около 0,7 т,п,о„ фага М13 тр18-НЕ4 связывают с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sal I длиной около 3,76 т.. плазмиды pLAPC и рестрикционным фрагментом EcoR I Sst I длиной около 2,0 плазмиды pLAPC. Связанная ДНК составляет целевую плазмиду pLPC - 167G9 трансформирующую Eocoli K12 RV308 Результирующие трансформанты E.coli K12

RV308/pLPC - 167G используют для получения больших количеств. ДНК плазмиды pLPC - 167G«

П р и м е р 4. Конструирование плазмиды pLPC - 167F

Плазмиду pLPC - 167F конструируют практически так же, как описано в примере 1 для конструирования плазмиды pLAPC с использованием сайт-специфичного мутагенеза и других стадий,

№ конструировании плазмиды pLPC - 167F фаг М13 тр18-НЕ1 подвергают сайт-специфичному мутагенезу с исп пользованием следующего мутагенизи- рующего олигонуклеотида:

33 173985434

5 -GACCAAGAACAACCAAGTATTCCGCGGCCTCATTGATC-3 J

Мутагенезированный фаг, получившийся в результате сайт-специфичного мутагенеза, назван М13 тр18-НЕ5.

Финальное конструирование плазми- ды pLPC - 167F проводят аналогично конструированию плазмиды pLAPC, описанному в примере 1C. Однако плазми- ду pLAPC конструируют с использованием двух рестрикционных фрагментов из плазмиды pLPC0 В отличие от этого при конструировании плазмиды pLAPC - 167F эти же два фрагмента получают из плазмиды pLAPC Причиной использования плазмиды pLAPC в качестве источника фрагментов вместо плазмиды

pLPC является облегчение рестрик- - ционного анализа при идентифицировании трансформантов плазмиды pLPC - 167F. Поскольку плазмида pLAPC меньше, чем плазмида pLPC - 167F, то, получая два фрагмента из плазмиды pLAPC, можно легко отличить родительскую плазмиду (pLAPC) от целевой плазмиды pLPC - 167F

Таким образом, при конструировании pLPC - 167F рестрикционный фрагмент Sst I - Sal I длиной около 0,7 т.п.о. фага М13 тр18-НЕ5 связывают с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sal I плазмиды pLAPC длиной около 3,76 . и с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sst I длиной около 3,76 т.п.о., и с рестрикционным фрагментом EcoR I - Sst I длиной около 2,0 топ.о. плазмиды pLAPC, Связанная ДНК составляет целевую плазмиду pLPC - 167F, которую трансформируют в Eocoli K12 RV308

П р и м е р 5 о Конструирование трансформированных аденовирусом человеческих эмбриональных почечных клеток линии 293 и трансформированных аденовирусом трансформантов клеток сирийского хомяка линии AV12 с ис-. пользованием плазмид pLPC - 167G и pLPC - 167F.

Человеческие эмбриональные почечные клетки линии 293 получены от Коллекции Культур Американского Типа под номером АТСС CRL 1573,, Трансформированные аденовирусом клетки сирийского хомяка линии AV12 также могут быть получены из Коллекции Культур Американского Типа, где они хранятся под № АТСС CRL 9595.

Клетки 293 выращивают в минималь- 5 ной среде Игла с 10%-ной термоинак- тивированной лощадиной сывороткой при 37 С (среду меняют дважды в неделю)„ Среда состоит из D MEM с 10% теляг чьей сыворотки, 50 мкг/мл ентамицина 0 и 10 мкг/мл Agua МЕРНУТСШ фитандио- на витамина К.„ Клетки субкультиви- руют удалением среды, промывают раствором Хенка, прибавляют 0,25%-ный трипсин (содержащий 0,2 г/л ЭДТА) 5 на 1-2 мин, промывают свежей средой, отсасывают и распределяют в новые сосуды с отношением субкультивирования 1:5 или 1:10.

За 1 день перед трансформированием 0 клетки высевают в количестве 0,7x10 клеток на 100 мм чашку Петри, Стерильную, осажденную этанолом плазмиду ДНК растворяют в ТЕ-буфере и используют для получения раствора 2Х ДНК-СаС1а, 5 содержащего 25 мкг/мл трансформирующей плазмидной ДНК (при трансформация плазмидами PLPC - 167F или pLPC - 167G обычно используют две плазмиды, плазмиду pLPC - 167F или 0 pLPC - 167G и плазмиду, содержащую селективный маркер) и 250 мМ СаС12° Получают 2XHBSS, содержащий 280 мМ NaCl, 50 мМ HepeS и 1,5 мМ фосфат натрия с рН, доведенным до 7,05 - 5 7,15. Раствор 2Х ДНК - СаС1г по каплям прибавляют к равному объему стерильного 2Х HBSS и продувают пузырьками в ходе прибавления ДНК, Позволяют формироваться ДНК-кальцийфосфат- 0 ному осадку без перемешивания 30 - 45 мин при комнатной температуре.

Затем осадок осторожно перемешивают отсосом пластиковой пипеткой и 1 мл (на пластинку) осадка прибав- g ляют прямо в 10 мл среды, роста, покрывающей реципиентные клетки Через 4 ч инкубирования при 37° С среду заменяют свежей и клетки инкубируют еще 72 ч до проведения селекции. Для 0 плазмид, не содержащих селективного маркера, функционирующего в эукариот- ных клетках, таких как плазмида pLPC - 167F или pLPC - 167G, в методике трансформирования используют е следующую смесь плазмид: вектор экспрессии по данному изобретению, не содержащий селективного маркера; вектор экспрессии, содержащий селективный маркер, работающий в эукариотных клетках. Для трансформации использовали плазмиды pSV2 - dhfr (АТСС 37146), pSV 2 - neo (ATCC 37149), PSV2 - Bpt (ATCC 37145) и pSV2 - hyg (NRRL В18039)„ Плазмида pSV2 - hyg придает устойчивость эу- кариотным клеткам-хозяевам к гидро- мицину В. Таким образом методика совместной трансформации позволяет отбирать клетки, содержащие плазмиды с селективным маркером

Плазмида pSV2 - neo придает -, устойчивость к неомицину (G418)o

Трансформацией клеточных линий 293 и AV 12 смесью плазмиды pLPC - 167F или pLPC - 167G и вектора, придающего устойчивость к гидромицину, и последующей селекцией гидромицин - устойчивых клеток получают большое число трансформантов 0

П р и м е р 6 о Отбор трансформан™ (тов с высокой секрецией о

Устойчивые к гидромицьну трансформанты, полученные в примере 5, выращивают в 100 мм дисках для тканевых культур или плотности в несколько cot клеточных клонов на диск. Среду декантируют и клетки дважды промывают.

Нитроцеллюлозные фильтры помещают в слой агара после удаления пузырьков воздуха пластинки инкубируют 1 - 3 ч при 37°С, затем помещают в PBS (50 мМ трис-HCl, РН 7,2 и 150 мМ NaCl).

Для поддержания жизнеспособности клеток в ходе анализа фильтров клетки покрывают сверху смесью, содержащей 2 мл 1,8% агара (47°С), 2 мл DME-солей (37°С) и 4 кл DME-солей с 20% телячьей сыворотки (37°С) и помещают в инкубатор при 37 С,

Все промывки и реакции проводят с фильтром, помещенным на качающуюся платформу. Сначала фильтры блокируют инкубированием при комнатной темпе5 - GCG CAG ТСА CCTG AAACG ACTCATTGATGGGAAGATGA-3

Способ конструиров нантной плазмидной ДН зимоген -.С человека, з том, что осуществляют .мента 0,7 кв плазмиды вание его с фрагменто фага MB mp18 с образо mp18HE1- проведение с ческого мутагенеза с олйгонуклеотида

с образованием фага М13 тр8НЕ2 или

5 -GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTGATTGATG-3 с образованием фага тр18НЕ4 или

51 GACCAAGAAGACCAAGTATTCCCGCGGCTGATTGATC-3T

EcoR I - Sst I фрагментом плаэмиды pLAPC и EcoR I - Sal I фрагментом

с образованием фага М13 mp18-HE5, ли- гирование фрагмента SstI - Sal I

размером 0,7 кв фага М13 mp18HE2 с

5

5

0

5

4°С

ратуре в 5%-ном молоке в PBS. Затем фильтры промывают 4 раза в PBS (5 мин на промывку). К фильтру прибавляют 10 мкг/мл биотинилированных поликло- нальных овечьих антител против чело- веческого белка С в 2,5%-ном бычьем сывороточном альбумине и инкубируют 1 ч при 37°С.

Фильтры 4 раза промывают PBS при

Затем авидин D и биотинилировэнную пероксидазу из ложечницы приморской подготавливают и добавляют так, как описано в инструкции поставщика Фильтры инкубируют с HRP-конъюгиро- ванным авидином D 1 ч при 4°С (если секретировано небольшое количество белка, то можно использовать более длительные инкубационные времена, т.е. ночь)о

Для проявления цвета индикатора прибавляют инкубируют при комнатной температуре до проявления цвета. Колонии, секретирующие наибольшее количество зимогена С человека, отмечаются на фильтрах не только более ранним появлением цвета, но и более темными пятнами на фильтрах

После проявления фильтров их сно- ва накладывают на первоначальные пластинки для соотнесения колоний с пятнами на фильтре. Колонии, секре- тирующие наибольшее количество зимогена С человека, отбирают и используют для получения зимогена«

Формула изобретения

Способ конструирования рекомби- нантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген -.С человека, заключающийся в том, что осуществляют выделение фраг- .мента 0,7 кв плазмиды рНС7, лигиро- вание его с фрагментом Sst I - Sal1 I фага MB mp18 с образованием М13 mp18HE1- проведение сайт-специфического мутагенеза с использованием олйгонуклеотида

размером 2,0 кв той же плазмиды или

37 173985438

тех же фрагментов фага М13 трНЕ4 и -карбоксилированного секретируемого

плазмиды pLAPC, или М13 трНЕЗ ибелка, легкую цепь белка С человека,

плазмиды PLAPC или pLPC - 167F COOT-дипептид лизин-аргинин, аргинин-ливетственно с последующим отбором, - зин или аргинин-аргинин со следующей

плазмид, кодирующих полипептид, вклкпаминокислотной и нуклеотидной послечающий сигнальньй пептид и пропептиддовательностью:

i/vii A:;I ы:и Ш1 ;I.N CYS HIS

PRO ALAVAL LYS PIIE PRO CYS CLY ARG PROTRPLYS ARG MET CLU LYS

LYS ARGSER HIS LEU LYS ARC ASP THR CI.UASPGLN GLU ASP GLN VAL

Ri R2ARG LEU ILC R3 GLY LYS MET THRARCARG GLY ASP SER PRO

TRP GLNVAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYSLYSLEU ALA CYS GLY ALA

VAL LEUILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THRALAALA HIS CYS MET ASP

GLU SERLYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLYGLUTYR ASP LEU ARG ARG

TRP GLULYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILELYSGLU VAL PHE VAL HIS

PRO ASNTYR SER LYS SER THR THR ASP ASNASPILE ALA LEU LEU HIS

LEU ALAGLN PRO ALA THR LEU SER GLN THRILEVAL PRO ILE CYS LEU

PRO ASPSER GLY LEU ALA GLU. ARC GLU LEUASNGLN ALA GLY. GLN GLU

THR LEUVAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SERSERARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARGASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHEILELYS ILE PRO VAL VAL

PRO HISASN GLU CYS SER GLU VAL MET SERASNMET VAL SER GLU ASN

ПЕТ LEUCYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARGGLNASP ALA CYS GLU GLY

ASP SERGLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHEHISGLY THR TRP PHE LEU

VAL GLYLEU VAL SER TRP GLY GLU GLY,CYSGLYLEU LEU HIS ASN TYR

GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

.

ILE ARC ASP LYS CLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

.

5 -GAC АСА GAA GAC CAA GAA GAC СЛА СТА

R4 R5 CGG CTC ATT R6 GGG AAG ATG ACC AGO CGG GGA GAC AGC CCC TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC ТСЛ AAG AAG АЛО СТО GCC TGC GGG CCA ,GTG CTC АТС СЛС CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC СЛС TGC ATG GAT GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTC CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC АТС AAG GAG GTC TTC GTC СЛС CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC ЛАТ САС АТС GCA CTC CTG СЛС CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC АТС TGC CTC CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC ЛЛТ CAG GCC GCC CAG GAC

АСС СТС GTG ACG GGC TGG GGC СЛС AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC AAG АСА ААС CGC АСС ТТС СТС СТС АЛС ТТС АТС AAG ATT CCC GTG GTC

р

CCG СЛС ЛАТ GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC ЛЛС ATG GTG TCT GAG ЛЛС ATG СТО ТОТ CCG GGC ЛТС CTC GGG GAG COG CAG GAT GCC TGC GAG GGC GAC ACT GGG GGG CCC ATG GTC GCC ТСС ТТС СЛС GGC ACC TGG ТТС СТО GTG GGC СТО GTG AGC TGG GOT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAt GGC GTT -TAG ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG АТС CAT GGG CAC АТС АСА GAC AAS GAA GCC CCC GAG AAO AGC TOO CCA CCT-l