Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК и способ получения зимогенной формы белка С человека Советский патент 1993 года по МПК C12N15/09 C12N15/15 C12P21/02 

Изобретение относится к новым ДНК- соединениям и векторам клонирования ре- комбинантных ДНК, кодирующих новые зимогенные формы белка С человека. Эти зимогены сконструированы таким образом, что типы гликосилирования являются совершенно иными по сравнению с зимогеном человеческого белка С дикого типа.Гликоси- лированйе, в частности, если углеводородные части содержат высокие уровни сиаловой кислоты, может играть важную роль в секреции белка и его функции. Новые зимогены изобретения конструируют таким образом, что каждую из областей гликосилирования изменяют отдельно. Векторы экспрессии позволяют получить простой и эффективный способ экспрессии указанных зимогенных форм белка С человека в реком- бинантных хозяйских клетках. Изобретение позволяет получить способ продуцирования

зимогенных форм белка С, которые при активации обладают более высокой амидоли- тической и антикоа гулирующей активностью, чем нативная форма белка С. Новые формы зимогеиов человеческого белка С отличаются от известных зимогенных форм аминокислотным последовательностями различных областей гликосилирования. Эти новые зимогенные формы белка С обладают определенными преимуществами при лечении заболеваний крови, в частности, нарушений коагуляции.

Белок С, витамин К-зависимый белок плазмы имеет большое физиологическое значение для регулирования гемостаза. Белок С синтезируется в виде неактивных молекул, называемых далее ранним белком С. Как будет подробно описано ниже, этот ранний белок подвергается сложному процес- сингу, что приводит к образованию

шьтя

СО

45ь

ий

СО

различных неактивных молекул. Неактивные секретируемые формы белка С именуются о настоящем описании зимогенным белком С. Активация белка С происходит в крови путем реакции с комплексом тромбодулинт- ромбин. Активированный белок С вместе с его кофактором белком S является антикоагулянтом, обладающим высокой физиологической активностью. Активированный белок С способствует предупреждению возникновения интерваскулярного тромбоза и распространению образовавшихся тромбов. Механизм действия активированной формы белка С и механизм активации неактивного зимогена в активную протеазу подробно описан в нескольких работах последних лет. В активации белка С участвует тромбин, конечная форма сериновой протеазы в каскаде коагуляции, и гликопротеин, ассоциированный с мембраной эндотелиальной клетки, и называемый тромбомодулином. Тромбомодулин образует тесный стехио- метрический комплекс с тромбином. Связываясь с тромбином, тромбомодулин резко изменяет функциональные свойства тромбина. Тромбин свертывает фибриноген, активирует тромбоциты и превращает кофакторы свертывания крови V и VIII в их активные формы, Va и Villa. И наконец, тромбин активирует белок С, однако, этот процесс протекает очень медленно и неэффективно, и кроме того, активация ингиби- руется физиологическим Са +. Напротив, тромбин п комплексе с тромбомодулином не свертывает фибриноген, не активирует тромбоциты и не превращает кофакторы свертывания Vn VII в их активные двойники Va и Villa, а становится эффективным акти- патором зимогенпого белка С в присутствии физиологического Са. Константа скорости активации зимогеиа белка С с помощью комплекса тромбомодулин-тромбин з 1000 раз превышает константу скорости процесса с участием лишь одного тромбина.

Длп более ясного представления регулирующей функции активированного белка С в свертывании, крови ниже приводится описание ферментативной системы коагуляции. Указанную систему коагуляции можно рассматривать как цепную реакцию с последующей активацией зимогена в активные сериновые протеазы. В итоге указанная цепная реакция продуцирует фермент тромбин, который посредством ограниченного протеолиза превращает фибриноген плазмы в нерастворимый гелеобрззный фибрин. Ключевыми стадиями в каскаде коагуляции являются превращение фактора саертыва- ния крови X и Ха с помощью фактора свертывания 1Ха и превращение протромбина в

тромбин с помощью фактора свертывания Ха. Обе указанные реакции происходят на поверхностях клеток, преимущественно на поверхности тромбоцитов, и для их осуществления необходимо присутствие кофакторов. Основные кофакторы, фэкторы V и VIII циркулируют в системе виде относительно неактивных предшественников, однако образование первых нескольких молекул

тромбина приводит к укреплению тромби- новых петель и активации кофакторов посредством ограниченного протеолиза. Активированные кофакторы Va и Villa ускоряют обе конверсии протромбина в тромбин

и факторы X в фактор Ха приблизительно на пять порядков величины. Актип /фованный белок С предпочтительно действует на кофакторы свертывания Va и Villa, т.е. активированные формы неактивных факторов V и

VIII путем протеолитической деградации, гидрослива и необратимого расщепления. Напротив факторы свертывания V и VIII являются плохими субстратами для активированного белка С.

Ценным кофактором для активированного белка С является белок В, другой витамин К-зависимый белок плазмы. Белок S в основном в 25 раз ускоряет гидролиз факторов Va и Villa, опосредованный активированным белком С,

Белок С известен специалистам как- ценное терапевтическое средство. Активированный белок С является нопым антитромбином с более широким

терапевтическим индексом по сравнению со стандартными антикоагулянтами такими, как гепарин, или антикоагулянтами типа гидроксикумарина для перорэльного введения. Ни зимогенный белок С, ни активированный белок С не являются эффективными до тех пор, пока не будет образовываться тромбин, поскольку его присутствие является необходимым для превращения свертывания V в Va и VIII в Villa, активированные

формы этих двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного белка С. Для активации зимогешюго белка С также требуется тромбин, при этом в отсутствии комплекса тромбомодулинтромбин превращение зимогена белка С в его активную форму протекает очень неэффективно.

Активированный белок С является пред- почтительным актикоагулянтом, поскольку он действует посредством инактивации кофакторов Va и Villa. Так как для превращения факторов V и VIM в их активные формы Va и Villa требуется тромбин, то белок С действует в качестве антикоагулянта л .пиь

после образования тромбина, В противоположность указанному активированному белку С, стандартные антикоагулянты сохраняют свое антикоагулирующее действие . ;в системе кровообращения о течение всего 5. периода введения их пациенту, что значительно увеличивает риск осложнения в виде кровотечения. Поэтому активированный белок С является предпочтительным антикоагулянтом широкого применения и может 10 быть использован вместо гепарина и гидро- ксикумарина в качестве альтернативного средства.

При некоторых заболеваниях, таких, как наследственный дефицит белка С, зимоген 15 белка С является чрезвычайно ценным терал певтическим средством. Человек с врожденным гомозиготным дефицитом белка С обычно умирает в раннем детстве от молниеносной пурпуры, часто встречающейся ле- 20 тальной формы диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Человек с гетерозиготным дефицитом белка С обычно тяжело страдает от рецидивирующих тром - 10 20 10

боэмболических осложнений. Клиниче было установлено, что концентраты бе плазмы, предназначенные для лечения мофилей В или дефицита фактора IX и держащие в качестве примеси белок являются эффективными для предупреж ния и лечения внутрисосудистого сверты ния при гетерозиготном дефиците белк Было также установлено, что при тромбо ческих состояниях, таких, как диссемиии ванное внутрисосудястое свертывани при заболеваниях, предрасполагающи тромбозу таких, как обширная травма, ширное оперативное вмешательство, и уровня белка С являются крайне низким

Для лучшего понимания механизма тивации белка С настоящего изобретен ниже представлена последовательно аминокислотных остатков для раннего б ка С человека. Указанная аминокислот последовательность и ее соответствующ области в целях настоящего изобрете также характеризует натишшй белок С ловека.

30 АО

5 -АТС TGG CAG СТС.АСЛ AGC СТО CTG СТО ТТС GTG GCC ACC TGG GGA ЛТТ H2N-MET TRP GLN LEU THR; SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY TIE ;. 5 10 15

боэмболических осложнений. Клинически было установлено, что концентраты белка плазмы, предназначенные для лечения ге- мофилей В или дефицита фактора IX и содержащие в качестве примеси белок С, являются эффективными для предупреждения и лечения внутрисосудистого свертыаа- ния при гетерозиготном дефиците белкз С. Было также установлено, что при тромботи- ческих состояниях, таких, как диссемиииро- ванное внутрисосудястое свертывание, и при заболеваниях, предрасполагающих к тромбозу таких, как обширная травма, обширное оперативное вмешательство, и рак, уровня белка С являются крайне низкими.

Для лучшего понимания механизма активации белка С настоящего изобретения, ниже представлена последовательность аминокислотных остатков для раннего белка С человека. Указанная аминокислотная последовательность и ее соответствующие) области в целях настоящего изобретения также характеризует натишшй белок С человека.

Использование: получение новых форм бе/.ка С человека. Сущность изобретения: разработан способ получения зимогенноп формы белка С путем конструирования ре- комбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка С. Указанные формы белка отличаются от на- тивного белка С более высокими амидолити- ческой и функциональной активностями, и имеют новые углеводородные структуры, В изобретении раскрываются также ДНК-соединения, векторы и трансформанты. 2 с.п.ф- лы, 7 ил., 6 табл,

15

20

25

30

TCC .GGC АСА ССЛGCT CCTCTT GAG ТСЛ GTG TTC TCG AGC AGC GAG CGT

SER GLY THR PROALA PROLEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

.2025 30

100Д10120 130 140

GCC CAC CAG GTGCTG CGGАТС CGC MA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG

ALA HIS GLN VALLEU ARG±LE ARG LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU

GAG CTC CGT CACAGC AGCCTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG АТС TGT

GLU.LEU ARG HISSER.SERШ1 GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILK CYS

50 ;.55 60

200 : 210 220 230 240

GAG TTC GAG GAGGCC AAGGAA-.ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAG АСА CTG

ASP PHE GLU GLU ALA LYSGLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THE LEU

65

70

35

40

250 - 260 270 280

GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAG GGT GAG CAG TGC TTG GTC TTG CCC ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO 8590 . 95

290 300 310 320 - 330 TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG.TGC АТС LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS 1LE 100105 110

75

JO

Х-7953А

115 :120 125 : 5

390 400 410 420 430 CGC TTC TGC GAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC ARG PHE CYS GLH ARG GLU VAL SER PHE LEU ASH CYS SER LEU ASP ASH

130135 -140 10 i ...... , .: ;-. ;; -.

i 440 450 460 . :470 480 GGC GGC TGC ACG CAT TAG TGC.СТА GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT GLY GLY CYS TIIR HIS TYR CYS LEU. GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145 . 150 , . .155 . . . - - ... 160

.15 . . -., :: . . . .. ..---

AGC TGT GCG CCT GGC TAG AAG CTG GGG GAC GAC CTG CTG CAG TGT CAC SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

: 165 . 170 175

20 : . . 530 540 550 . 560 570

CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT. GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG flET GLU LYS

580 590 600 610 620 AAG CGC ACT CAC CTG ЛАЛ CGA .GAC АСА GAA GAC CAA GAA GAC C.AA GTA LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP TOR GLU ASP СШ GLU ASP GLN VAL

195200 205 30

210215 220 35 :

680 ; 690 : 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA TRP GLH VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA 225 , 230235 240 40

GTG CTC АТС CAC CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC CAC TGC ATG GAT VAL-LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU TIER ALA ALA HIS CYS MET ASP

, 245250 :. 255 45 ., X-7953A 770 780 790 800 810

GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG . .- 260; 265 270

5 -

820 830 840 850 860 TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC АТС AAG GAG GTC TTC GTC CAC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

275 ; 280285 10

870 880 890 900 910

ССС ААС TAG AGO AAG AGC ACC ACC GAG AAT GAC АТС GCA CTG CTG CAC PRO ASH TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

290295 300 15

920 930 940 950 960 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ЛТС-TGC CTC LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN Tlffi ILE VAL PRO ILE CYS LEU 305. 310 315 - 320 20

CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC.AAT CAG GCC GGC CAG GAG PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

325 330 335 25

1010 1020 v 1030 1040 1050 ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAG CAC AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC Tlffi LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARC GLU LYS GLU ALA

340345 350 30

1060 1070 1080 1090 1100 AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC ЛАС ТТС АТС AAG ATT CCC GTG GTC , LYS ARG ASH ARG THR PHE VAL LEU ASN PIE ILE LYS ILE PRO VAL VAL 355360 365

35-: .

1110 1120 1130 1140 1150 CCG GAG AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC .. PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370 . 375 380

1160 1170. . 1180 1190 1200

ATG CTG TGT GCG.GGC АТС CTCGGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC

MET LEU CYS ALA GLY ILE LEUGLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

385 390395 . 400

45

X-7953A- ч

1210 1220 1230 1240

GAC ACT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTG ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

405 410415 5 1250 1260 1270 1280 1290 GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC СТГ.-САС AAC TAG VAL GLY LEU VAL SEE TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

420425 430 10

1300 1310 1320 1330 1340 GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAG CTC GAC TGG АТС CAT GGG CAC GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

435440 445 15 . ,

1 1350 1360 1370 1380 АТС AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-3 ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

450455 460 .20

где А- деэоксиаденил, G -дезоксигуанил, С

- дезоксицитидмл, Т - тимидил, ALA - ала- нин, APG - аргинин, ASN - аспарагин, ASP

- асларагиновая кислота, -СООН - карбоксильный конец, CYS - цистеин, GLN - глута- мин, GLU - глутаминовая кислота, GLY - глицин, HIS - гистидин, На - аминоконец, ILE - изолейцин/LEU - лейцин, LYS - лиг зин, МЕТ - метионин, РНЕ - фенилаланин, PRO - пролин, SER - серии, THR - треонин, TRP - триптофан, TYR - тирозин, и VAL - палии.

Изображенная выше ДНК-последовательность происходит от клонов кДНК, полученных от мРНК печени человека, которая кодирует белок С человека. Каждому специалисту известно, что способность генетического кода к вырождению дает возможность сконструировать много.различных ДНК-последовательностей, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность. Таким образом, изображенная выше кДНК- последовательность для раннего белка С человека является лишь одной из многих возможных последовательностей, кодирую- щих ранний белок С человека. При констру- ировании кДНК-клонов, 5 поли G последовательность, 3 поли С последовательность, и 5 и 3- последовательности распознавания рестриктирующего фермен- та Pstl были построены у концов кДНК, кодирующей белок С. Два из указанных кДНК-клонов были модифицированы в целях построения ДНК-молекулы, содержащей кодирующую последовательность раннего белка С человека, а также участки ДНК, кодирующей нетрэнслиров.знную мРНК у 5 и 3 - концов кодирующей области. Указанную ДНК-молекулу вводили в Pstl-сайт плазмиды рВР322 в целях постро- ения плазмиды рНС7. Таким образом, плаз- мида РНС7 содержала вышеуказанную кодирующую последовательность и указанные ниже дополнительные последовательности изображена лишь одна нить молекулы: 5- CTGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCATGG C.GG CAG CAC CGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA ССС GCC ССТ АСА GGT GCC ACT GCC ТСС AGA - 3 и 5 - CGA CCC ТСС CTG CAG GGC TGG GCT ТТТ GCA TGG САА TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССТ GCA G - З у концов 5 и 3 соответственно кодирующей нити последовательности, кодирующей ранний белок С человека. Благодаря комп- лементарности при спаривании оснований ДНК, последовательности одной нити двух- нитееой ДНК-молекулы вполне достаточно для определения последовательности противоположной нити. Плазмида pl-IC7 может быть выделена стандартным способом из штамма E.coli K12 RRI/pHC7, депонированного и являющегося частью постоянного фонда коллекции клеточных культур Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (RR). Пеория, Иллинойс. Указанная культура E.coli K12 PPI/pHC7 может быть получена из NRRL. под входящим номером NRRL B-15926. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рНС7 представлены на фиг.2.

Ниже приводятся также схематическое изображение раннего белка С.

14243 197198 199200 211212 461

ргс-рго

KR

ЛР

ЛИС

«-не-

рге-рго - аминокислотные ост атки 1-42 раннего белка С человека, которые кодируют сигнальный пептид и пропентид белка С человека, играющие важную роль в направлении секреции и у-карбоксилирования белка С.

LC- аминокислотные остатки 43-197 раннего белка С, которые после пост-трансляционной модификации содержат легкую цепь (LC) двухцепочечного зимопена (образованного из одноцепочечного зимогена путем удаления дипептидз, как указано ниже) и активированных форм белка С; KR - аминокислотные остатки 198-199 раннего белка С человека; указанные остатки, очевидно, могут быть удалены (на основе гомологии с бычьим белком С.) с помощью двухстадийного способа, заключающегося сначала в расщеплении (либо между остатками 197-198, либо между остатками 199- 200), а затем о воздействии карбоксипептидазой или аминопептидазой с образованием дву/цепочечного белка С; АР - аминокислотные остатки 200-211 раннего белка С, содержащие пептид активации, который удаляют из зимогепных форм белка С в целях получения активированного белка С;

АНС - аминокислотные остатки 212-4G1 раннего белка С, которые после пост-трансляционной модификации содержат активированную тяжелую цепь (АНС) активного белка С;

НС - тяжелая цепь двухцепочечной формы зимогена белка С. которая после посттрансляционной модификации состоит из аминокислотных остатков 200-461, АР и АНС.

Зимоген человеческого белка С является предшественником сериновой протеазы, синтезируемым п печени и присутствующим в крови. Для экспрессии новой биологической активности белок С нуждается в посттрансляционной модификации, для которой необходим витамин К. Двухцепочечный, с дисульфидной связью зимоген белка С может быть получен из одноцепочечного зимо- гена путем ограниченного протеолиза. Указанный ограниченный протеолиз, очевидно, включает в себя расщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199. Активация двухцепочечного зимогена в активную сериновую протеазу представляет собой протеолйтическое расщепление пеп- тидной связи APG-LEU (остатки 211 и 212). Указанное расщепление высвобождает до- декапептид (остатки 200-211), пептид активации, который включает в себя амино-концы большей (тяжелой) цепи двух- цепочечной молекулы зимогена. Белок С является значительно гликосилированным; зрелый фермент из плазмы содержит 15- 23% углеводов. Белок С также содержит не- которое число редко встречающихся аминокислот, например, у-карбоксиглута- миновую кислоту и /3-гидроксиаспарэгино- вую кислоту (эритро-1 -/ -гидроксиаспартат). .у-Карбоксиглутаминовая кислота (gla) мо- жет быть получена из остатка глутаминовой кислоты путем у-глутамилкарбоксилирова- ния с использованием микросомной карбок- силазы, для которой в качестве кофактора требуется витамин К.

Ниже схематически представлена активация белка С человека. При этом каждому специалисту известно, что порядок стадий, показанный на схеме, не обязательно отражает порядок стадий при метаболическом пути in vivo

pre-pro-LC-KR AP-AHC ранний белок.С пост-трансляционная модифика- ция, т.е. у-карбоксилирова- ние конкретных остатков глутами- новой кислоты, /3-гидроксили- рование остатка аспарагиновой кислоты, и гликосилирование секреция,удаление остатков 1-42, которое может состоять из более, чем одного протеолитического расщепления

LC-KR-AP-AHC одноцепочечный зимоген удаление остатков 198-199; около 90% зимогенного белка С, найденного в крови человека, является его двухцепочечной формой (S-S-дисульфидная связь)

С активация тромбин- $-$ Двухцепочечный

I зимоген j AHC-AR

тромбомодулином /-С

,-$ активированный дне белок с

Изобретение относится к получению новых соединений, векторов, трансформантов и способов рекомбинантной экспрессии новых зимогенов белка С.

Были использованы следующие обозначения:

Ad2LP - главный подний промотор аде- новируса типа 2.

Аминокислотные остатки в белках и пептидах обозначены аббревиатурами, представленными в табл.1.

ApR - ампициллин - устойчивый фенотип или его несущий ген

В К - ДЕК от ВК-вируса

ЕпЬилиэихансер-энхансер ВК-вируса.

ер или SV40 ер - ДНК - сегмент, содержащий SV40 - ранний промотор гена Т-ан- тигена, области связывания Т-антигенз,

40 - энхансер, и точка инициации репликации SV4C.

у-карбоксилирование - реакция присоединения карбоксильной группы к глутами- новым кислотам у у-углерода.

у-карбоксилированный белок - белок, в котором некоторые остатки глутаминовых кислот были подвергнуты у-карбоксилиро- ванию.

GBMT - транскрипционная единица - модифицированная единица регулирования транскрипции, содержащая знхансер Р2 ВК-вируса, расположенный непосредственно выше регуляторного элемента главного позднего промотора аденовируса; позднмй главный промотор аденовируса-2, элемент поли-GT, ст имулирующий указанный промотор, и ДНК-последовательность, содержащую разделенную на три части сплайсерную лидерную последовательность аденовируса. GBMT-транскрипционная единица находится приблизительно на Hindll - рестриктиционном фрагменте 900 п.с. плазмиды pGTIV-ДНК, кодирующая интрон, так называемая внедряющаяся последовательность.

ММТрго - промотор мышиного гена ме- таллотионеина-1.

Ранний белок - полипептид, продуцированный после трансляции мРНК-транскрип- та. до любых пост-трансляционных модификаций. Однако пост-трансляционные модификации, такие, как у-карбоксили- рование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспаргиновой кислоты, могут иметь место перед тем, как белок будет полностью транслирован о мРНК-транскрипта.

NoeR - ген. несущий устойчивость к не- омицину, который .может быть также использован для переноса устойчивости к антибиотику G418.

рА - ДНК - последовательность, кодирующая сигнал полиаденилирования.

Промотор - ДНК-последовательность, которая направляет транскрипцию ДНК-в РНК.

Активность белка С - любое свойство белка С, ответственное за протеолитиче- скую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую антикоагулирующую или профибринолитическую активности. Методы испытания белка на антикоагулирующую активность хорошо известны.

Вектор клонирования рекомбинантной ДНК - любой аген.т, например агент хромосомной интеграции, автономно реплициру- ющиеся плазмиды, и фаги, содержащие ДНК-молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных ДНК-фрагментов.

Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК- любой вектор клонирования рекомбинантной ДНК, в который вводят промотор в целях стимулирования генного продукта.

Вектор рекомбинантной ДНК - любой вектор клонирования и экспрессии рекомбинантной ДНК.

Репликон - ДНК-последовательность, контролирующая и направляющая автономную репликацию плазмиды или другого вектора.

Фрагмент рестрикции - любая линейная ДНК-последовательность, генерированная с помощью одного или нескольких рестриктирующих ферментов.

Восприимчивая клетка-хозяин - клетка- хозяин, которая неспособна развиваться в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединения, если отсутствует ДНК-сегмент, несущий устойчивость к данным соединениям.

TcR - тетрациклин - устойчивый фенотип или ген, несущий указанный фенотип.

Трансформация - введение в хозяйскую клетку-реципиент ДНК, изменяющую генотип указанной клетки-реципиента.

Трансформант - хозяйская клетка-реципиент, подвергнутая трансформации.

Трансляционная актив ирующая последовательность - любая ДНК-последовательность, включающая последовательность, кодирующую область связывания с рибосо- мо й и кодон инициации трансляции, такой, как 5 -ATG - 3, который обеспечивает трансляцию мРНК-транскрипта в пептидили пол- ипептид.

Зимоген - ферментативно неактивный предшественник протеолитического фермента. Используемый в настоящем описании термин зимоген белка С относится к

секретируемым неактивным одноцепочеч- ным или двухцепочечным формам белка С. На фиг. 1 представлены рестрикцион- ный сайт и функциональная карта плазмиды

pLPC-Q097; на фиг.2 - сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC- Q248; на фиг.З - сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC-Q313; на фиг.4 - сайт рестрикции и функциональная

карта плазмиды pLPC-Q329; на фиг.5 - сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pGTC; фиг. 6 представляет собой сайт рестрикции и функциональную карту плазмиды pGT-d; на фиг.7 - сайг рестрикции и

5 Функциональная карта плазмиды PGT-li.

Изобретение позволяет получить ДНК- соединения, кодирующие экспрессию новых зимогенных форм белка С человека. Некоторые способы получения зимогена на0 тивного белка С человека и раннего белка С человека известны. Способы прототипов направлены на экспрессию зимогенных форм белка С человека, аминокислотная последовательность которых не отличается от ами5 ноки слотной последовательности зимогенных форм, присутствующих в крови человека. При экспрессии в..определенных линиях укариотических клеток, таких, как линия 293 клеток почки человека, секретиру0 ется зимоген нативного белка С человека с новым типом гликосилирования, который отличается от формы зимогена, обнаруженного в крови человека.

Изобретение относится к получению зи5 могенных форм белка С человека, которые имеют измененные типы гликосилирования вследствие сайт-напраоленных изменений в последовательности аминокислотных остатков. Указанные активированные зимо0 генные формы имеют более высокую амидолитическую и антикоагулирующую активность по сравнению с нативным белком С человека. Изобретение также относится к ДНК-соединениям, векторам экспрессии

15 рекомбининтной ДНК, линиям трансформированных клеток и способам рекомбинантной экспрессии указанных новых зимогенных форм белка С человека. Способ продуцирования ухазанных форм зимогена

0 белка С человека заключается в том, что:

А) эукариотическую хозяйскую клетку трансформируют с помощью фактора рекомбинантной ДНК, причем указанный пек- тор содержит:

5

(О ДНК-последовательность, кодирующую последовательность аминокислотных остатков, которая от аминоконца до карбоксильного конца включает в себя следующую аминокислотную последовательность:

171838411 18

Х-7953Л:

10 МЕТ ТЕР GLN LEU THE SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA TIffi TRP GLY ILE

SER GLY TIffi FRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG

ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARC LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU 15

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLUGLUALA ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASPTHR LEU

20 ALA PHE TRPSERLYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VALLEU PRO

LEU GLU HISPROCYS ALA SER LEU GYS CYS GLY HIS GLY THRCYSILE

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY 25:

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU R1 CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

.j

30 SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TR LYS ARG MET GLU LYS

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP TIffi GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL 35

ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET TIffi ARG ARG GLY ASP SER PRO

TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA

40 VAL LEU ILE HIS .PRO SER TRP VAL LEU TIffi ALA ALA HIS CYS MET ASP

. GLU SER LYS LYS LEU LEU VALJUJG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

3A TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

PRO R2 .TYR SER LYS SER THE TIffi ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

5 LEU ALA GLN PRO ALA TIffi LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLlfbEU- ASN GLN ALA GLY GLN GLU

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

10LYS ARG R3 ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL

PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN

15 MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY TIffi TRP PHE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

20

GLY VAL TYR TIffi LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRQ-COOH

где RI выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, Ra выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, Рз выбирают из группы, содержащей ASN и GIN и Нз выбирают-из группы, содержащей ASN и GIN; R4 выбирают из группы, содержащей ASN и GIN;

(ti) промотор длп регулирования экспрессии указанной ДНК-последовательности;

B) хозяйскую клетку, трансформированную в стадии (А) культивируют при условиях, способствующих экспрессии указанной ДНК-последовательности и

C)указанный зимоген белка С выделяют из культуры.

Изобретение также относится к ДНК- соединениям, используемым в целях получения новых зимогенных форм белка С человека. Все указанные соединения кодируют препропептид, содержащий сигнальный пептид для направления секреции и пропептид из у-карбоксилированного (посредством воздействия витамин К-зависи- мой карбоксилазы), белка. Такие пропептидные последовательности хорошо известны специалистом. См., например, Suttle и др., 1987, Proc.Natl. Acad. Sei. 34:634-637. Предпочтительно для простоты конструирования, если последовательность, кодирующая си(нальный пептид, и последовательность, кодирующая пропептид, будут происходить от аминокислотной последовательности пре-пропептида у-кар- боксилированного белка. Примерами таких у-карбохсилированных белков являются (но не ограничиваются ими) фактор VII, фактор IX, фактор X, протромбин, белок S, белок Z и белок С, ДНК-последовательность, кодирующая пре-п ропептид белка С человека яв- ляется предпочтительной для введения в вектор настоящего изобретения.

Кроме того, ДНК-соединения изобретения содержат последовательность кодирования для легкой цепи белка С человека, которая расположена непосредственно за гфе-пропептидкодирующей последовательностью и в трансляционной рамке считывания. Легкая цепь белка С человека содержит аминокислотные остатки от 43 до 197 включительно, раннего белка С, как указано выше. Амино-концевые части витамин К-зависимых белков плазмы, также, как ами- но-концеоая часть легкой цепи белка С, имеют область связывания с кальцием. Области связывания с кальцием указанных белков плазмы, таких, как фактор VII, фактор IX, фактор X, протромбин и белок S могут быть использованы аналогично областям связывания с кальцием легкой цепи белка С человека. В одной из новых форм зимогена (Q97) изобретения остаток аспарагина в положении 139 в легкой цепи заменяли на остаток глутэмина. удаляя тем самым область гликосилирования.

ДНК-соединения изобретения, кроме того, содержат последовательность, кодирующую дипептид LYS-ARG (КР), которая расположена непосредственно за

последовательностью, кодирующей легкую цепь и в трансляционной рамке считывания с этой последовательности. Двухосновный дипептид, такой, как LYS-ARG расположен в раннем белке со стороны карбоксильного

конца легкой цепи. Ориентация дипептида LYS-ARG в экспрессированном белке не относится к целям изобретения. Для целей изобретения, двухосновные дипептиды,такие, как LYS-LYS или ARG-ARG, эквивэлентны дипептиду LYS-ARG. Однако для целей изобретения, дипептид LYS-ARG, который представляет собой дипептид нативного белка С человека, является предпочтительным.

Непосредственно ниже за кодонами для LYS-ARG-дипептида расположена последовательность, кодирующая пептид активации. При этом следует отметить, что зимогены изобретения в основном отличзются от нативных форм зимогенов белка С человека, описанных ниже.

Кроме того, другие замещения аминокислот, в дополнение к замещению в поло- . жении 139 в легкой цепи, также может

способствовать уёилению амидолитической и антикоагулирующей активностью пол- . ученного зимогена. Выражение полученный зимоген указывает на то, что, хотя замещения описываются со ссылкой на положения в раннем белке С человека, однако ранний белок С человека должен быть сначала выделен (в результате удаления амино- кислотных остатков от 1 до 42) для получения зимогенной формы. Таким обра- J

зом, замещение остатка аспарагина в положении 139 (в раннем белке С человека) остатком глутамина приводит к новой форме зимогена настоящего изобретения. Замещение остатка аспарагина (в

активированной тяжелой цепи) в любом из положений 290, 355 или 371 остатком глутамина приводит к новой форме зимогена изо- , бретения.

5 Таким образом предпочтительные новые формы зимогена белка С человека изобретения могут быть получены в результате секреции и процессинга молекул раннего белка С человека, имеющих следующую аминокислотную последовательность:

21 1838411 22

Х-7953Д

MET TRP GLN LEU.THR SER LEU LEU LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE

SER GLY THE PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

J W

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO , LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU €YS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

k

35ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

X-7953A

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU Rt CYS SER LEU ASP ASN

.

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

5 SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

PRO.ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG .ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL

ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO

, TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA

.15 VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS 20

PRO RZ TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

25 PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASH GLN ALA.GLY GLN.GLU

- /THE LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SEE ARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARG R3ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL

PRO HIS R4GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN

MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

35 ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

GLY VAL TYR THE LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ; 40

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

где Ri выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, R2 выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, Ra выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, и R4 выбирают ш группы, содержащей ASN и GIN.

Новый зимогем 0,097 включает замещение остатка аспарагина в положении 139 остатком глутамина. Зимогенр,248 включает замещение остатка аспарагина в положении 290 остатком глутамина. Зимоген 0,313 включает в себя замещение остатка аспарагина в положении 355 остатком глутамина, а зимоген 0,329 включает в себя замещение остатка аспарагина в положении 371 остатком глутамина.

При этом следует отметить, что вследствие вырождения генетического кода некоторые ДНК-соединения могут кодировать изображенный выше полипептид. Следовательно, описанные ниже конструкции и примеры получения предпочтительных ДНК-соединений, векторов и трансформантов изобретения являются всего лишь иллюстративными и не ограничивают объема изобретения. Кроме того, замещение GIN вместо ASN является иллюстративным и не ограничивает объема настоящего изобретения, поскольку могут быть использованы и другие.замещения, за исключением CYS или PRO. К тому же следует отметить, что различные замещения отдельных- аминокислот настоящего изобретения могут сочетаться для создания новых зимогенов.

Все ДНК-соединения изобретения были получены посредством сайт-специфического мутагенеза гена белка С человека. Подвергнутые мутагенеэу зимоген-кодирующие молекулы затем вводили в эукариотические векторы экспрессии для осуществления экспрессии генов зимогенов с помощью главного позднего промотора аде нови руса-2. Указанные векторы содержат также элемент энхансера Р2 ВК-вируса, предназначенный для усиления экспрессии от промотора. Векторы были трансформированы в E.coli K12 AGI-клетки и депонированы в основном фонде, клеточных культур Северной региональной исследовательской лаборатории в Peoria, Иллинойс 61604 от 9 января 1990 г. Конкретные культуры, даты депонирования и входящие номера пред- ставлены в табл.2.

С помощью стандартной техники получают культуры и выделяют плазмиды, которыезатем трансфецируют непосредственно в хозяйские эукариотические клетки в целях прордуцирования зимо- генных форм белка человека С. Плазмиды предпочтительно трансформировать в хо1 зяйские клетки, которые экспрессируют непосредственно ранний генный продуктаде- новируса EIA, поскольку ВК-энхансер, действующий на векторной основе, наиболее эффективно усиливает экспрессию в присутствии EIA. Для специалистов следует отметить, чтб имеется ряд клеток-хозяев, которые экспрессируют или которые могут быть адаптированы для экспрессии непосредственно раннего генного продукта большого ДНК-вируса. Предпочтительными линиями клеток являются линия клеток почки человека 293 депонированная в Американской коллекции типовых культур под номером допуска АТСС GRL 1573 или линия

клеток АУ12 сирийского хомячка (АТСС . 9595). Однако наиболее предпочтительной является линия клеток 293 почки эмбриона человека.

Дли получения более высоких уровней

экспрессии из депонированных векторов могут быть вырезаны гены, кодирующие различные формы зимогена белка С, и лиги- рованы в вектор, содержащий транскрипционную единицу G В МТ. В частности,

плазмида pGT-h, которая содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину, может быть получена из NRRL (NRRL В-18591). Плазмидный остов получают путем переваривания плэзмиды рестрпктирующим ферментом Bell с последующим выделением плазмидной ДНК из darn-штамма E.coli, несущего метилазу, например, GN48 (NRRI В- 15725). Каждый из этих новых генов зимогена может быть выделен из их соответствующих плазмид путем Bell-переваривания. Векторный остов очищают и дефосфорилируют, а затем любой из генов нового-зимогеиа настоящего изобретения лигируют в Bell-сайт, Плэзмиды, содержащие гены нового зимогена, расположенные за GBMT-транскрипциопной единицей, затем трансформируют в клетках 293, культи- ви руют, и полученные новые зимогеиы очищают от культуры с помощью стандартной техники. Способ очистки белка С человека из культуры, например, описан Уап.

Соединения изобретения также включают в себя зимогенные формы, генерированные при секреции ранних белков настоящего изобретения, Таким образом, соединения изобретения включают ДНК-ко- дирующие последовательности, векторы экспрессии, направляющие экспрессию

5 указанных последовательностей, ранние белки, продуцированные при трансляции мРНК-транскриптов, генерированных из указанных кодирующих последовательностей, зимогены, продуцированные при секреции указанных ранних белков и

активированные производные некоторых зимогенов.

ДНК-соединения изобретения могут быть также синтезированы химически или путем объединения рестрикционных фраг- ментов, или путем объединения указанных способов, хорошо известных специалистам. Механизм синтезирования ДНК также хорошо известен специалистам и может быть использован для конструирования соедине- ний изобретения.

Характерные векторы изобретения содержат ВК-знхансер, предназначенный для стимулирования транскрипции главным поздним промотором эденовируса кодиру- ющей последовательности изобретения. При этом каждому специалисту известно, что существует большое количество эукари- отических промоторов, энхансеров и зкс- прессирующих векторов, которые обычно используются в аналогичных целях и могут использованы в способе настоящего изобретения. Специалистам также известно, что эукариотический вектор экспрессии может быть использован и без энхансерного элемента. Ключевым аспектом изобретения является не конкретный энхансер, если он присутствует, или промотор,.используемый для управления экспрессией зимогсна белка С, а новая кодирующая последователь- иость и соответствующие белки, продуцированные из указанной последовательности.

Однако выбор векторных элементов, таких, как энхансеры, промоторы, и селекти- руемые моркеры, может сильно повлиять на конечные уровни болкз, продуцируемого эукариотической клеткой-хозяином. В публикации Европатента 0245949, опубл. 19 ноября 1987 г. вводимого в предлагаемое описание посредством ссылки, описывается.ряд экспрессирующпх еекторов для зи- моген.ч нативного белка С, s которых используется ВК-знхансер в целях стимулирования эукзриотического промотора, на- правляющего экспрессию раннего белка С человека. Указанные векторы обеспечивают экспрессию особенно высоких уровней, если их трансформировать в эукариотические клетки, которые также эхспрессяруют не- посредственно ранний генный продукт „большого ДНК-вируса, такого, как EIA-зде- новируса. Как видно из описания характерных векторов pGT-Q097-h, pCT-Q248-g, pCT-Q313-h и pCT-329-h, раскрываемых в данном описании изобретения, способ экспрессии генного продукта CBMT-EIA является особенно предпочтительным для использования в нем векторов настоящего изобретения.

Изобретение не ограничено использованием какой-либо определенной эукариотической клетки-хозяина. Ряд эукариотических хозяйских клеток являются доступными, т.е. находятся в хранилищах, например, в АТСС, Роквилль, MD 20852, и могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Выбор конкретной клетки-хозяина в определенной степени зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого для управления экспрессией ДНК- соединений, кодирующих белок С. Так как ранний белок С человека и производные раннего белка С человека изобретения подвергаются значительной пост-трансляционной модификации, то некоторые хозяйские клетки являются более предпочтительными для использования векторами настоящего изобретения. В публикации Европатента N 0245949 и в работе Grlnel и др. 1987, Bio/Technology 5:1189 указывается, что для получения рекомбинантного продукта у- карбоксилированных белков, таких, кок белокС человека, особенно предпочтительными являются оденовирус- трансформированные клетки почки эмбриона человека, Одной из таких аденовирус-трзнсформированных эмбриональных клеточных линий почки чнлопекя является линия 293, которая может быть получена из АТСС под входящим помором АТСС CRL 1573. Линия клеток 293 является также предпочтительной для использования с векторами настоящего изобретения,

Однако преимущества продуцирования у-корбоксилированного белка, такого, как зимоген белка С человека, в аденовирус- трансформированной линии клеток не ограничиваются использованием аденопирус- трэнсформированных клеток почки эмбриона человека. Фактически, аденовирус- трансформироознные клетки являются исключительными хозяевами для продуцирования карбосилированного белка С человека. Одной из наиболее предпочтительных линий клеток этого топа является линия клеток AY12-664 (обозначаемая ниже AY12), которую можно получить из АТСС под входящим номером АТСС CRL 9595. Линию клеток AY12 конструировали путем инъ- ециропаиия сирийского хомячка путем введения п загривок человеческого адено- вируса 12 и выделения клеток из полученной опухоли. Ниже, в примере 3, описана трансформация линий клеток 293 и AY12 с помощью характерного вектора рСТ-0.097-1.

Векторы изобретения могут быть трансформированы и экепрессированы в ряде эукариотических клетках-хозяевах, например, в клетках млекопитающих. Векторы настоящего изобретения, которые не имеют селектируемый маркер для выделения и идентификации стабильных эукариотиче- ских трансформантов, используются не только для временных анализов, но и также для совместной трансформации. Векторы изобретения могут также содержать последовательности, которые стимулируют репликацию в E.coli поскольку обычно более эффективно продуцировать плазмидную ДНК в E.coli, чем а других хозяйских организмах. . - Экспрессия последовательностей, кодирующих белок С человека и содержащихся в векторах настоящего изобретения, происходит в тех клетках-хозяевах, в которых конкретный промотор ассоциирован с функциями структурного гена. Характерные клетки-хозяева, подходящие для использования их в изобретении, представлены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, многие хозяйские клетки млекопитающих обладают необходимым клеточным механизмом распознавания и надлежащего процессинга сигнального пептида на ранних белках изобретения и обеспечиаают пост-трансляционные модификации, такие, . как гликосилированио, у-карбоксилирование, и / -гидроксилирование, как это имеет место в белке С человека, присутствующего в плазме крови. Однако, как указывалось выше, оптимальный пост-трансляционный про- цессинг HP С происходит в аденовирус- трзнсформировэнных клетках. Для трансформации указанных эукариотических клеток может быть использован широкий диапазон векторов, обсуждаемых ниже, однако, примеры описываемых ниже векторов не ограничивают объема изобретения.

Векторы р5У2-типа содержат сегменты генома SY40, которые составляют определенная зукариотическая транскрипционная единица-промотор (ер), нитрон (IYS), и область полиаденидированип (рА). При отсутствии Т-аитигена SY4ft, плазмидные векторы рЗУ2-типа трансформируют хозяйские клетки млекопитающих или других эукариотические клетки путем интеграции хромосомной ДНК в хозяйскую клетку. Был сконструирован ряд плазмидных векторов типа pSY2, где SY40-npOMOTOp осуществляет транскрипцию инсертированного гена. Указанные векторы могут быть использованы с кодирующими последовательностями настоящего изобретения и являются доступными, так как находятся в Американской коллекции типовых культур (АТСС) в

Роквилле, Мэриленд, или в Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL) В Пеории, Иллинойс.

Плазмиды pSY2-dhfr (АТСС 37146) содержит мышиный ген дигидрофолат-редук- тазы (dhfr) под контролем раннего промотора SY40. Известно, что при определенных условиях ген dhfr может быть амп- лифицирован или реилицирован в

0 хозяйской хромосоме. Эта аплификация может включать ДНК-последовательности, примыкающие к dhfr-гену, например, последовательность, кодирующую белок С настоящего изобретения, и таким образом может

5 быть использована для увеличения проду- цированип эимогенов белка С настоящего изобретения.

В плазмидах, которые были сконструированы п целях экспрессии раннего белка С

0 и зимогенов белка С изобретения в клетках млекопитающего и других эукгриотических клетках-хозяевах, может быть -использован широкий ряд промоторов. Однако изобретение ни в коем случае не ограничивается кон5 кретными эукариотаческими промоторами, представленными о настоящем описании изобретения в Качестве примера. Такие промоторы, как поздний промотор SY40 или эукариотические промоторы, описанные

0 Bucher и др., 1986, Nuc.Aeicis, Res. 1.4(24): 1009, или промоторы от эукариотиче- ских генов, например, таких, как экстроге- нипдуцируемый ген куриного овальбумина, гены интерферона, глюкокортикоид-инду5 цируемый ген тирозин-аминотрансферазы, ген тймидин-киназы и главный ранний и поздний гены аденовируса, могут быть легко выделены и модифицированы с использо- ваниемлекторов . экспрессии

0 рекомбинантных ДНК, сконструированных в целях получения зимогена белка С в эука- риотических клетках-хозяевах. Эукариотические промоторы могут быть также использованы в тандеме для управления

5 экспрессией кодирующей последовательности настоящего изобретения. Кроме того, известно большое количество ретровиру- соо, которые инфицируют широкий ряд эукариотических клеток-хозяев. Длинные

0 концевые повторы в ДНК ретровирусов часто кодируют промоторную активность и поэтому могут быть использованы для управления экспрессией кодирующих последовательностей настоящего изобрете5 ния.

Плазмида pRSYCat (АТСС 37152) содержит участки длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса (RCY), который, как известно, поражает кур и другие хозяйские клетки. Последовательности длинных концевых повторов RSY могут быть выделены на 0,76 KB Ndel-Hlndlll -рестрикционном фрагменте плазмиды pRSYcat. Промотор в длинном концевом повторе RSY является подходящим для его использования в векто- pax изобретения. Плазмида pMSYi (NRRL В-15929) содержит длинные концевые повторы вируса мышиной саркомы (MSY), который, как известно, поражает мышей и другие хозяйские клетки. Эти последова- тельности повторов могут быть использованы в качестве промоторов в векторах настоящего изобретения. Промоторы мышиного гена металлотионеина (ММТ) также является весьма подходящим для использо- вания в эукариотических хозяйских клетках и в векторах настоящего изобретения. ММТ- промотор присутствует 15 кв плазмиды pdBPV-MMTneo (ATCC 37224), которая может служить в качестве исходного материа- ла для конструирования других плазмид изобретения.

Можно осуществить множество модификаций и вариаций иллюстративных ДНК- последовательностей и плазмид изобретения. Например, вырождение генетического кода предусматривает замещение нуклеотидов на .протяжении пептидкодирующих областей, а также в стоп-сигнале трансляции без альтерации полипептидкодирующей последовательности могут быть получены из известной аминокислотной или ДНК-последовательности белка С человека с помощью конструирования с использованием стандартных методов синтеза или сайт-специфического мутагене- за. Синтетические методы могут быть осуществлены, например, в соответствии с процедурами, описанными Hakura и др.

Следовательно, изобретение неограни- чивается ДНК-последовательности и плаз- мидами, представленными в описании в качестве примера.

После трансформации вектора настоящего изобретения в эукариотических клет- ках-хозяевах, полученные трансформанты могут быть отобраны на основе селектируемого фенотипа. Этот селектируемый фенотип может быть наделен любым селектируемым маркером, присутствующим в векторе экспрессии или в другом векторе, .совместно трансформированным с вектором экспрессии в клетке-хозяине. После отбора трансформантов, желательно идентифицировать те трансформанты, кото- рые экспрессируют наиболее высокие уровни целевого белка,колированного вектором Экспрессии. Указанная идентификация особенно важна после процедуры совместной трансформации, которая генерирует ряд

трансформантов, содержащих лишь плзз- миду с селектируемым маркером и не содержащих вектор экспрессии. В приведенном ниже примере 4 описана не только процедура идентификации клеток, экспрессирую- щих и секретирующих целевой белок, но и также процедура количественной оценки секретированного белка по сравнению с другими клетками, исследованными, с использованием этого способа. Описанная процедура также предусматривает выделение жизнеспособных клеток, секретирующих наиболее высокие уровни целевого белка.

Способы активации зимогенных форм белка С человека до активированного белка С (АРС) являются давно отработанными и хорошо известны специалистам. Белок С может быть активирован с помощью одного тромбина, комплекса тромбин-тромбомоду- лин, яда гадюки Рассела, или с использованием широкого ряда других средств. Активность зимогеноо белка С человека может быть измерена после активации тромбином с noMOuibto анализов на амидолитическую или антикоагулирующую активность. Активацию тромбином и анализы на активность белка С амидолитическую и антикоэгулирующую активность осуществляли по Grinnell и др., 1987, Biotechnology 5:1189-1192 (вводится в настоящее описание посредством ссылки). Амидолитические активности углеводородных мутантов белка С представлены о табл.4.

Молекулы зимогена, использованные в анализах табл.4, были оценены количественно с помощью анализа ELISA с использованием моноклональных антител, которые не способны вступать в реакцию с мутантами или производными в такой степени, как это делают молекулы дикого типа, из которых происходят эти антитела. Затем проводили очистку и количественную оценку на основе содержания белка, в результате чего получали данные, приведенные в табл.5.

Кроме того, помимо более высокой ан- тикоэгулирующей активности производных, представленных в табл.5, мутант Q313 показал повышенное сродство к тромбину, что привело приблизительно к трехкратному увеличению степени активации одним тромбином или тромбином в сочетании с кофактором тромбомодул ином. Это увеличение скорости активации может быть использовано при создании более восприимчивой формы зимогена белка С для клинических применений, а также для улучшения способа расщепления зимогена белка С в целях гюлучения активированного белка С. В

табл.б представлен кинетический параметр активации эимогена Q313.

Представленные результаты являются средними из трех независимых определений. Значения определялись с помощью линейно-регрессионного анализа.

Активированный белок С обладает значительной анти/ромботической активностью при использовании его для предупреждения распространения внутривенных тромбов и для предупреждения смертности и повреждения органов при сепсисе, вызванном грамотрицательной бактерией, эндотоксикоза и диссеминиро- ванного внутрисосудистого свертывания. И особенно важно, что повышенная функциональная активность активированных производных белка С изобретения позволяет использовать сниженные дозы при вышеуказанных клинических показаниях, что способствует повышению безопасности лекарственного средства.

Активированные рекомбинантные зи- могены белка С настоящего изобретения могут быть использованы в целях предупреждения в лечении широкого ряда приобретенных заболеваний сопровождающихся внутрисосудистым свертыванием, таких, как тромбофлебит, эмболия легких, периферический артериальный тромбоз, эмболия, вызванная поражением сердечных или периферических артерий, острый инфаркт миокарда, тромботические шоки, и диссеминированное внутрисосудистое свертывание. Указанные производные белка С могут быть также с успехом использованы при лечении большого количества пациентов, страдающих гетерозиготным дефицитом белка С, проявляющимся рецидивирующим тромбофлебитом, и гомозиготным дефицитом белка С с осложнением в виде молниеносной пурпуры. Положительные терапевтические показания активированной белок С дает при использовании для предупреждения эмболии легких и тромбофлебита, обычно обрабатываемых небольшими дозами гепарина.

Аналогично, ..Зимогены белка С настоящего изобретения могут быть использованы для лечения эмболии, вызванной в результате образования тромба в периферических артериях, а именно в сбнных артериях, и которая не поддается лечению или достаточному предупреждению с помощью обычно используемых средств, включая средства для подавления действия тромбоцитов, антикоагулянты для перорального введения. или их комбинации.

Зимогены изобретений могут быть также использованы при лечении острых инфарктов миокарда, поскольку после активации указанные зимогены обладают про- фибринолитическими свойствами. Эти зимоген ы могут быть введены вместе с тканевым активатором плазминогена при острой стадии инфаркта миокарда. После рассасывания обтурирующего коронарного тромба указанные зимогены могут вводиться еще несколько дней в целях предупреждения повторного приступа инфаркта миокарда.

Активированный белок С используется при лечении диссеминированного внутри- сосудистого свертывания, При экстенсив5 ных клинических исследованиях пациентам с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (DIC) вводили гепарин и антикоагулянты для перорального введения, однако получили при этом разочаровывающие

0 результаты. При лечении диссеминированного внутрисосудистого свертывания активированный белок С, а также зимогены изобретения обладают значительным преимуществом по сравнению со стандартны5 ми антикоагулянтами.

Стандартные антикоагулирующио средства в частности варфарин. используются при лечении инваэивных злокачественных опухолей. Многие опухолевые клетки проду0 Цируют вещества, которые способствуют активации системы коагуляции, что приводит к локальному отложению фибрина. Эти отложения фибрина играют роль так называемых гнезд, в которых злокачественные

5 клетки могут делиться, образуя метастазы. Однако введение варфарина или других стандартных антикоагулянтов в сочетании с более интенсивными и эффективными средствами хемотерапии не представляется воз0 можным, поскольку указанная терапия ведет к резкому снижению количества тромбоцитов, и тромбоцитопения .в сочетании с варфарин-терапией может вызвать у пациента серьезные осложнения в виде сильных

5 кровотечений. Производные белка С изобретения, аналогично активированному белку С, которые, будучи более селективными, чем стандартные антикоагулянты, и имея при этом более высокий терапевтиче0 ский,.индекс, чем гепарин или перорзльные антикоагулянты, являются относительно безопасными для пациента с тромбоцитопе- нией, что таким образом делает возможным лечение пациентов с инвазивным раком с

5 помощью эффективной и интенсивной хе- мотерапией в сочетании с зимогеном белка С настоящего изобретения.

Зимогены и их активированные двойники настоящего изобретения могут быть использованы для изготовления

фармацевтических композиций в соответствии со стандартной техникой, при которой зимоген белкэ С человека или активированный белок С смешивают с фармацевтически приемлемым носителем. Соответствующие носители и их составы, включая и другие белки человека, например, альбумин человеческой сыворотки, описаны в Remington Pharmaceutical Sciens 16 th, 1980, Маек Publishing Co.. изд. изд. Osol и др., и вводятся в описание посредством ссылки. Указан- ные композиции будут содержать эффективное количество эимогенэ белка С или его активированную форму в сочетании с соответствующим количеством фармацевтически приемлемого носителя. Указанные композиции белка С могут быть введены парентерально, или другим способов, пригодным длл снабжения кровотоко эффективным средством.

Представленные ниже примеры иллюстрируют способы получения характерных соединений, Ьектороо и трансформантов настоящего изобретения, однако он не ог- ранмчипают объема изобретения.

П р и м о р 1. Выделение плазмиды pIL PC-Q097.

Из Северной региональной исследоиа-. тельской лаборатории (Пеория, Иллинойс 61604) получали лиофилы E.coli K12 AGl/pIL PC-Q097 (номер допуска NRRL В-18600), Эти лиофилы сливали в пробирки, содержащие 10 мл LB-среды (10 г Бактотриптона, 5 г экстракта бэкто-дрожжей, и 10 г NaCI на 1 л рИ доводили до 7,5) и инкубировали, и течение 2 ч при 32°С, затем культуры обрабатывали 50 мкг/мл амлициллином и инкубировали при 37°С в течение ночи.

Небольшую часть ночной культуры по- .мещали на чашки с LB-агаром (LB-среда с 15 г/л бакто-arapa), содержащие 50 мкг/мл ам- пициллкна, для того, чтобы получить изоллт единичной колонии E.coli K12 AGl/pLPC- Q097. Полученную единичную колонию ино- кулировали в 10 мл LB-среды. содержащей 50 мкг/мл эмпициллина, и инкубировали, при этом энергично перемешивая, в течение ночи при 37°С. 10 мл ночной культуры ино- кулмровали п 500 мл LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубиропапи при37°С. энергично размешивая до тех пор, пока культура не достигнет стационарной фазы.

Следующая процедура является адаптированной процедурой, описанной Маниати- сом и др., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory).

Клетки собирали центрифугированием при 4000 г в течение 10 мин при 40°С, а надосадочную жидкость сливали. Клеточный осадок промывали в 100 мл охлажденного льдом буфера STE (0,1 М NaCL. 10 мМ Трис-HCI, рН 7,8, и 1 мМ ЭДТК). После промывания клеточный осадок ресуспендиро- 5 вали в 10 мл раствора 1 (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCI, рН 7,0, и 10 мМ ЭДТК), содержащего 5 мг/мл лизоцима, и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем к обработанным лизоцимам клеткам добавля0 ли 20 мл раствора 2 (0,2 н NaCI и 1 % SDS) и полученный раствор слегка размешивали. Смесь инкубировали на льду в течение 10 мин.

К .смеси лизироианных клеток добавля5 ли 15 мл 5 М охлажденного льдом ацетата

калия (рН 4,8) и полученный раствор разме шивали. Раствор инкубировали на льду о

течение 10 мин. Раствор 5 М ацетата калия

получали путем добавления 1 1,5 мл ледяной

0 уксусной кислоты к 28,5 мл воды и ВО мл 5 М ацетата калия, полученный в результате раствор представлял собой соотношение калия к ацетату как ЗМ к 5М.

Смесь лизированных клегок ценгрифу5 гировали в устройстве Beckman SW 27 (или в его аналоге) при 20000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. ДНК клеток и дебрис образовывали на дне пробирки осадок. Около 36 мл нздосадочной жидкости выделяли и до0 бавляли 0,6 объемов изопропанолэ, затем размешивали и полученный раствор оставляли на 15 минут при комнатной температуре. Плазмидную ДНК собирали путем центрифугирования при 12000 г в течение

5 30 мин при комнатной температуре. Нэд- осадочную жидкость сливали, ДНК-осадок промывали 70% этанола при комнатной температуре. Этаноловую промывку сливали, а осадок осушали в вакуумном эксикато0 ре. Затем осадок ресуспендировали в 8 мл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТК).

.- К ДНК-раствору добавляли 8 г CsCI. На каждые 10 мл С С1-ДНК-рзствора добавляли

5 около 0,8 мл раствора бромида этилия 10 мг/мл в воде. Конечная плотность раствора составляла около 1,55 г/мл, а концентрация бромида этилия составляла около 600 мкг/мл, Полученный раствор переносили на

0 центрифужные пробирки Веек а типа 50, заполняли доверху парафиновым маслом, запаивали, и центрифугировали при 45000 об/мин в течение 24 ч при 20°С. После центрифугирования в видимом диапазоне

5 спета наблюдались две полосы ДНК. Затем снимали крышку пробирки и удаляли нижнюю полосу ДНКс помощью шприца с иглой для подкожных инъекций №21, которую вводили через боковую сторону центрифужной

пробирки,

Этидийбромид удаляли путем неодно- i кратного экстрагирования водонасыщения 1-бутанолом. CsCI удаляли путем диализа против IE-буфера. После экстрагирования буферным фенолом, а затем хлороформом ДНК осаждали, промывали 70% этанолом и осушали. В результате получали около I г плазмиды pLPC-0.097, которую хранили при 4°С а ТЕ-буфере при концентрации около 1 мкг/мкл. На фиг. 1 представлены сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC-Q097. Аналогичным образом, из соответствующих клеток-хозяев, также взятых из NRRL, были выделены плазмиды PL PC-Q24G, pi. PC-Q313, и pL PC-Q329. Сайт рестрикции и функциональные карты этих плазмид представлены на приложенных к данному описанию фигурах.

Пример 2. Конструирование плазми- - ды pGT-Q097-h.

В целях продуцирования высоких уровней зимогенов белка С человека, плазмиды PLPC-Q097, pL PC-Q248, pPC-Q313 и pL PC- 0329 могут быть трансформированы непос- редственно в эукариотических клетках/хозяевах (предпочтительно 293- клетках). При этом могут быть получены лаже более высокие уровни экспрессии и секреции продукта, если ген, кодирующий мугантным зимоген, лигировать в вектор так, чтобы экспрессия гена упраплялась GBMT-транскрипционпой единицей.

Одним из таких векторов является плаз- мида pGTC, где ген дикого типа зимогена белка С человека запускается транскрипционной единицей GBMT; Ген дикого типа белка С может быть легко удален из вектора Bcll-рсстрикционном фрагменте, и на этом фрагменте в вектор может быть введен любой ген настоящего изобретения. Переваривание плазмидной ДНК рестриктазой ВсП-ингибировали путем метилирования у аденина в последовательности 5 -GАТС-3 . Следовательно, плазмиду pGTC получали из хозяйских клеток E.coil, в которых отсутствует адеиин-мегилаза такал, которая кодируется dam-геном, продукт которого метилирует остаток аденина в последовательности 5 -GATC-3 . В К12 GM48 E.coli (NRRL B-15725) отсутствует функциональная метилаза, и поэтому эти клетки являются подходящими хозяевами для использования их в получении ДНК-плазми- ды pGTC, которую используют в качестве исходного материала при конструировании плаэмидных производных.

Клетки К12 GM48 E.coli культивировали и делали компетентными для трансформации, которую осуществляли в соответствии с процедурой примера 1, используя плазмиду pGTC. Трансформированные клетки помещали на чашки с L-агаром, содержащим ампициллин, и после того, как ампициллин- устойчипые трансформанты К12

GM48/pGTC E.coli образовывали колонии, одну из таких колоний использовали для получения ДНК-плазмиды pGTC согласно процедуре примера 1. Около 1 мг полученной pGTC-плззмидной ДНК суспендировали приблизительно в 1 мл ТЕ-буфера. Аналогично, могут быть получены плазмид- ные-ДИК из pGT-h и pGT-d. Плазмида pGT-cl содержит транскрипционную единицу GBMT, в которой отсутствует ген в ВсП-сай5 те, так, чтобы можно было легко ввести любой ген. Плазмида pGT-d содержит также мышиный ген clhfr, поэтому любой транс- формант может быть отобран или амп- лифицирован с использованием

0 метотрексат-устойчивого фенотипа. Плазмида pGT-h содержит GBMT-транскриптон, Bel 1-саГгг для свободного введения целевого гена, и ген, несущий устойчивость к гидро- мицииу. Штаммы К12 AG E.coli, содержа5 щие каждую из этих плазмид, были депонированы в NRRL 18 января 1990 г. Эти штаммы доступны под номерами допуска NRRL В-18591 (для К12 AG /pCT-d). NRRL В-18592 (для К.12 AGi/pGT-h), и NRRL B0 18593 (для К12 AGI/pGTC). Сайт рестрикции и функциональные карты этих плазмид представлены на фигурах, приложенных к описанию.

Около 10 мкл pL РС-0097-плазмидной

5 ДНК, полученной из 6М48-клеток;смешивали с 20 мкл 10.x Bcll-рестрикционного буфе- ра (100 мМ-Трис-HCI. рН 7,4, 1,5 М KCI, 100 мМ MgCl2 и 10 мМ ДТТ), 20 мкл 1 мг/мл В А, Б мкл, 5 мкл рестриктирующего фермента

0 Belt ( 50 Ед., по определению Bethesda Research Laboratories (BRL), из которого были получены все использованные в примерах фер.менты), и 145 мкл воды, и полученные в результате реакционные сме5 си инкубировали в течение 2 ч при 37°С, Описанные реакции рестриктирующих ферментов обычно прекращали путем экстрагирования фенолом, а затем хлороформом, после чего ДНК осаждали, промывали зта0 HoJidiM и ресуспендировали в ТЕ-буфере. Пе- реваренные ДНК затем подвергали электрофорезу на 1% згарозном геле, и 1400 п.о. - фрагмент рестрикции, содержащий мутантный ген, очищали, используя би5 орадиологический набор Prep-A-Gene в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем плазмиду pGT-h выделяли из К12 AGI/pGTC E.coli (NRRL B-18593) в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, культивировали в GM48, а затем выделяли

в соответствии с процедурой, описанной в примере 2. После чего pGT-h плазмидную ДНК переваривали рестриктирующим ферментом, как указано выше, и большой фрагмент выделяли и очищали. Этот фрагмент сектора доводили до 90 мкл объема ТЕ-бу- фером (рН 8.0) фрагмент вектора доводили до 9 мкл объема ТВ-буфером (рН 8.0), а затем добавляли 10 мл (0,05 Ед.). кишечной щелочной фосфатазы теленка в целях де- фосфорилирования концов вектора. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С, затем добавляли 10 мкл 500 мМ EGTA и

реакцию инкубировали в течение 45 мин

при 65°С для инактивации фермента. После этого реакцию экстрагировали смесью фенола и хлороформа, осаждали этано лом, промывали, и ресуспендировали о 20 мкл .воды.

Затем около 7 мкл (10 кг) остова Bcll-ne- реваренного вектора смешивали приблизительно с 1 мкл (100 кг) около 1400 п.о. Bcli-рестрикционного фрагмента плазмиды pLPC-0097, 1 мкл 10хлигазногобуфера(0,5 Трис-HCI. рН 7,6, 100 мМ MgCl2, 100 мМ ДТТ и 500 мк/мл BSA) и 1 мкл ДНК-лигазы Т4. После чего реакционную смесь лигирования инкубировали в течение 12-16 часов при 1б°С. Реакция лигирования приводит к получению плазмид, содержащих мутантный , ген зимогена, ориентированный для транскрипции от GBMT-траискрипционной единицы, или к получению плазмид, в которых ген лигировэн в противоположном направлении. Те плазмиды, которые содержат ген в подходящей для транскрипции ориентации, обозначали плазмидой pGT-Q097-h.

Замороженные компетентные клетки E.coli K12 AGI получали от Strategene, 3770.

Tansey Roud, Сан Диего, Калифорния 92121. Около 5 мкл реакционной смеси лигирования смешивали с 100 мкл аликвотой компетентных клеток, после чего смесь клеток и ДНК инкубировали на льду в течение 1 ч, затем подвергали теплопому шоку при 42°С в течение 45 с, и охлаждали на льду приблизительно в течение 2 мин. Смесь клеток и ДНК разбавляли 1,0 мл ОС-среды в пробирке Falcon 2059 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. 100-мкл аликвоту помещали на LB-агаровые чашки, содержащие ампи- циллин и инкубировали при 37°С до тех пор, пока не появлялись колонии.

Полученные колонии культивировали отдельно, а плззмидную ДНК отдельных колоний исследовали с помощью рестрикци- онного анализа. Выделение плазмидной ДИК осуществляли в небольших количествах в соответствии с процедурой примера 1, но CsCI-стадию не проводили, до тех пор,

пока соответствующие трансформанты К12 AGI/pGT-Q097-l E.coli не будут идентифицированы. После этого осуществляли получение высокоочищенных плазмид в большом 5 количестве. В соответствии с указаниями примеров 1 и 2, любой из мутантных генов зимогена может быть легко клонирован в любой из GBMT-векторов с образованием плазмид pGT-Q097-h, pGT-Q248-h, pGT- 0 Q313-hn PGT-Q329-h.

Пример З. Конструирование трансформантов аденовирус-трансформирован- ной линии клеток почки эмбриона человека 293 и аденовирус-трансформированной ли5 нии клеток сирийского хомячка AY12 с использованием плазмиды pGT-Q097-l.

Линия клеток почки человеческого эмбриона 293 была взята из Американской коллекции типовых кул.ьтур под номером

0 допуска АТСС CRL 1573. Линия аденовирус- трансформированных клеток сирийского хомячка AY12 также была взята из АТСС № АТСС CPL 9595. Процедура трансформации клеток 293, как клеток-хозяев описана ниже,

5 однако, указанная процедура в основном, применима также клиниям наиболее типичных зукариотических клеток, включая клетки линии AY12, и к-векторам экспрессии настоящего изобретения.

0 Клетки 293 были получены из АТСС (под номером CPL 1573) в 25-мм 2-колбе, содержащей сплошной монослой около 5,5 х 106 клеток в минимальной поддерживающей среде Игла (Gibco)с 10% термо-инактипиро5 ванной лошадиной сыпороткой. Колбу инкубировали при 37°С, а среду меняли два разя в неделю. Среда состояла из DM EM (Gibco), дополненной 10% околоплодной сывороткой,.теленка, 50 мкг/мл гентамйцина, и 10

0 мкг/мл витамина Ki, фитонадионэ АквэМефитон R Merck Sharp & Dohme, Merck & Co.,

Jnc., West Point, PA, 19486). Клетки субc культивировали путем удаления среды, промывания сбалансированным солевым

5 раствором Хзнкса {Gibco), добавления в течение 1-2 мин 0,25% трипсина (содержащего 0,2 г/л ЭДТК), промывания свежей средой и диспергирования в новых колбах при отношении субкультивации 1:5 или 1:10.

0За день до трансформации клетки засевали при 0,7 х 10 клеток на 100-мм чашку. Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК, растворенную в воде, использовали для получения 2 х

5 ДНК-СаС 2-раствора. содержащего 25 мкг/мл трансформирующей плазмидной ДНК и 250 мМ CaCl2 2 х HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса) содержал 280 мМ fxlaCI, 50 мМ Нере и 1,5 мМ фосфата натрия с рН доведенным до 7,05-7,15. Раствор 2 х ДНК-С0С12 по капле добавляли к равному объему стерильного 2 х HBSS. 1-мл стерильную пластиковую пипетку с ватной пробкой вставляли о смесительную пробирку, содержащую 2 х HBSS и путем продувки вводили пузырькк добавляя при этом ДНК. После этого раствор оставляли на 30-45 мин при комнатной температуре без перемешивания для образования преципитата фосфат кальция-ДНК.

Затем полученный преципитат смешивали путем мягкого пипетирования пластиковой пипеткой и 1 мл (на чашку) преципитата добавляли непосредственно к 10 мл среды для выращивания, которая покрывает клетки-реципиента. После 4-х часового инкубирования при 37°С среду заменяли свежей средой: а клетки оставляли для инкубации в течение еще 72 ч, а затем подавали селекционное давление. Для плззмид, которые не содержат селектируемый маркер, функционирующий в эукарио- тических клетках, трансформацию осуществляют с использованием смеси плазмид: вектор экспрессии изобретения, в котором отсутствует селектируемый маркер, и вектор экспрессии, который содержит селектируемый маркер, функционирующий в эукариотических клетках. Для использования в такой системе совместной трансформации имеется ряд подходящих векторов, например, плазмиды pSY2-dhfr (ATCC 37146) pSY2-neo (ATCC 37149), pSY2-gpt (ATCC 37145) и pSY2-hyg (NRRL В-18039). Плазмида pSY2-hyg несет вектор устойчивости к гидромицину В для эукариотических клеток-хозяев. Указанная техника совместной трансформации позволяет осуществлять отбор клеток, содержащих плаямиду с селектируемым маркером. Затем эти клетки идентифицировали на содержание обеих трансформирующих плазмид. Изобретение также включает векторы экспрессии, содержащие селектируемый маркер для эукариотических клеток, и для них не требуется использования совместной трансформации., . Для клеток, трансфицированных плаз- мидами, содержащими ген, несущий устой- чивость к гидромицину, такими, как плазмида pGT-Q097-h, к среде для культиви- рооания добавляли гидромицин В до получения конечной концентрации около 200 мкг/мл. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 2-4 недель, меняя среду с интервалами 3-4 дня. Полученные гидроми- цин-устойчивые колонии переносили в отдельные колбы с культурой в целях определения их свойств. Плазмида pSY2- пео несет устойчивость к неомицину (вме-

сто неомицина также используют G418) и отбор на С418-устойчивые колонии осуществляли, в основном в соответствии с процедурой отбора для гидромицин-устойчиоых

клеток, за исключением того, что G418 добавляли до конечной концентрации 400 мкг/мл.

Использование гена гидрофолат-редук- тазы (dhfr) или производного dhfr-гена, не0 сущего устойчивость к метотрексату (dhfr-mtx), в качестве селектируемого маркера для введения гена или плазмиды в линию клеток с дефицитом dhfr и последующее использование метотрексата для амплифици5 рооания числа копий плазмиды известны. Клетки 293 являются dhfr- положительными, поэтому 293-трансформанты, включающие в себя плазмиды, содержащие ген ghfr, не отбираются лишь на оснопе dhfr-положи0 тельного фенотипа, который способен к росту в среде, где отсутствуют гипоксантин и тимин. Линия клеток, в которых отсутствует функциональный ген dhfr и которые являются трансформированными dhfr-содержащи5 ми плазмидами, могут быть отобраны на основе, dhfr -фенотипа. М хотя процедура использования ghfr в качестве селектируемого и амплифицируемого маркера при dhfr-продуцирооании клеток еще недоста0 точно хорошо изучена, однако, в специальной литературе имеются свидетельства, что dhfr может быть использован в качестве селектируемого маркера и для амплификации гена при dhfr-продуцировании клеток. Изо5 бретение не ограничивается селектируемым маркером, используемым в векторах экспрессии. Кроме того, могут быть использованы амплифицируемые маркеры, такие, как гены металлотионеина, гены аденозин0 деаминазы, или члены семейства множества генов устойчивости, представителем которого является, например, ген Р-гликоп- ротеина.

В результате трансформации линий кле5 ток 293 с использованием плазмид pGT- Q097-h, pGT-Q248-h, pGT-Q313-h и pGT-Q329-h получали ряд трансформантоь. анализ этих трансформантов описан в примере 4.

0 Р р и м е р 4. Отбор клеток, секретиру- ющих мутанты зимогена человеческого белка С.

Гидромицин-устойчивые трансформанты, полученные в примере 3, культивирова5 ли на 100 мм чашках с тканевой культурой при плотности в несколько сотен клеточных клонов на чашку с тканевой культурой. Среду декантировали, а клетки дважды промывали 5-мл аликвотами сбалансированного солевого раствора Хэнкса (Gibco). Растоор

стерильного 0,45% агара (эгароза Сигма типа 4, каталожный номер А3643, Сигма Кеми- кал Компани, P.O.Box 14508, Сент-Луис. МО 63178) получали путем смешивания 1 мл 1,8%-но агара 47°С с 3 мл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ОМЕ) (Gibco)(37°C), и 2 мл полученного 0,45%-но- го агарового раствора наслаивали понерх клеток.

Нитроцеллюлозные фильтры (Sclileicher и Schuell. Jnc., Keene, NH 03431) кипятили, а затем автоклавмровали 2 ч в целях удаления смачиваемого агента, который является токсичным для клеток. После чего фильтры Помещали поверх слоя аг ара, и после удаления пузырьков ооздуха чашки инкубировали при 37°С в течение 1-3 ч. Затем фильтры, которые были предварительно помечены для указания первоначальной ориентации их на чашках в целях облегчения последующей идентификации колоний, снимали и помещали в PBS (50 мМ Трис-HCI, рН 7,2, и 150 мМ NaCI).

Для поддержания жизнеспособности , клеток, на чашках во время анализов на фильтрах, клетки покрывали 8 мл смеси, содержащей 2 мл 1,8%-ного агара (47°С), 2 мл ДМЕ-солевого раствора (37°С) и 4 мл ДМЕ- солевого раствора, содержащего 20%-ной околоплодной сыворотки толенка (37°С). Затем клетки помещали в инкубатор при 37°С.

Все промывки и реакции, проводимые на фильтрах,- осуществляли, располагая фильтры на качающейся платформе. Сначала фильтры блокировали путем инкубации при комнатной температуре в5%-ном молоке в PBS. Затем фильтры промывали (5 мин на промывку) в PBS четыре раза. После этого к фильтрам добавляли 10 мкг/мл биоти- . нилированного козьего поликлонального антитела против белка С человека в 2,5%- ном альбумине бычьей сыворотки в количествах, достаточных для покрытия фильтра. и проводили инкубацию при 37°С в течение 1ч.

Очистка белка С для его последующего использования в целях получения антитела против белка С, может быть осуществлена способом, описанным Kisi el, 1979, T.Clin, Invest. 64, 761. Поликлональное антитело может быть получено способом, описанным в Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, E.A. Kabat, опубл. в 1968 Холтом, Ринехартом и Уинстоном., Моно- клональное антитело, которое также пригодно для использования в анализе, может быть получено способом, раскрытым в работе Kohler и Milstein, 1975, Nature 256:495, или раскрытым в патенте США N; 4696895, публ. ЕРО N« 205046, Laurell и др., 1985,

FEB 191 (I), Sutukl и др., 1985, Т, Blochem 97:127-138, и ЕРО- публ, Ns 138222. Авидин D и биотинилированную пероксидазу хрена (HRP), используемого в анализе, получали в 5 Векстаотаин-ч наборе (Вектор лзборато- риез, Инк., 30 Ингоулд Роуд, Берличгем, СА 94010). Биотин был также получен из Вектор-лабораторий. Инк.

Фильтры четыре раза промывали PBS

0 при 4°С. Затем получали и добавляли зви- дин D и биотилировэнную пероксидазу хрена в соответствии с инструкциями, приложенными к набору Векстатасин (Вектор лабораториез). Фильтры инкубировали

5 с НРР-конъюгированным авидином D в течение 1 ч при 4°С (более длительное время инкубировзния, т.е. в течение ночи, может быть использовано при секретмронании небольших количеств белка), после чего филь0 тры четыре раза промывали PBS при 4°С.

Для проявления на фильтрах окраски индикатора, к 50 мл PBS и 30 мкл 30% Н202 добавляли около 30 мг НРР-окрашивающе- го реагента (4-хлоро-1-нафтол, Сигма), рас5 творенного в охлажденном льдом 100%--ом метаноле. Эту смесь добавляли к нитроцел- люлозным фильтрам, которые инкубировали при комнатной температуре до тех пор, пока не появится окраска. Колонии, секре0 тирующие наибольшее количество зимоге- на человеческого белка С изобретения, будут отмечаться на фильтрах не только бо- лее ранним появлением окраски, но также и более темными пятнами на фильтре.

5 После появления окраски фильтры перегруппировывают с первоначальными чашками для определения того, какие колонии с какими пятнами ассоциируются на фильтре. Колонии, секретирующие наиболь0 шее количество зимогена белка С изобретения, отбирают и используют для получения зимогена.

При этом следует отметить, что описанный выше анализ просто иллюстрирует спо5 соб идентификации высокосекретирующих линий клеток. В способе изобретения может быть с успехом использован целый ряд методик анализа. Например, может быть использована реакция с двойным антителом,

0 в которой биотинилированное козье антитело против белка С заменяют козьим антителом против белка С IgG и биотинилированным антителом против козьего IgG.

5 Зимогенные мутанты могут быть очищены от клеточных культур. Из клеток, экс- прессирующих рекомпинантный продукт, удаляют надосадочную жидкость и проводят очистку на колонке Farmacia Fastlow Трис-НС.(рН 7,4), 0,15 М NaCI, 5 мМ ЭДТК и 4 мМ бензамидина, Супернатант культуры доводили до рН 7,4 путем добаоления Тристромбомодулин, затем измеряли амидоли- тическую активность продукта путем гидролиза трипептидного субстрата S-2366

: HCi (рН 8.0), и вводили 5 мМ ЭДТК и 4 мМ(полученного из лаб. Helena). Антикозгули бензамидина. Затем супернатант наносилирующую активность определяли путем прона смолу а колонке и промывали 3 х объема-дления периода действия частично

ми колонки Трис-НС (оИ 7,4), 0,15 М Nad, 5 мМ ЭДТК, а затем 3-мя объемами колонки 20 мМ трис-НС, 0,15 М NaCI, и 4 мМ бензамидина. Рекомбииантный продукт элюиро- вали с колонки, используя в качестве элюента буфер, содержащий 10 мМ CaCl2 в 20 мМ Трис-НС (рН 7,4), 0,15 М NaCI, 5 мМ бензамидина.

Специфическую активность продукта определяли с помощью процедуры, описан- нойОПпеМидр,, 1987, B otechno ogy5:1189- 1192,следующим образом, Концентрированный и диализованный продукт элюата колонки сначала активировали иммобилизованным комплексом тромбинактивированного тромбопластина с использованием реагентов от лаборатории Helena.

Формула изобретения 1. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка.С, предусматривающий конструирование вектора, включающего область репликации, селективный маркер, промотор, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок С, о т л и- ч а ю щ и и с я тем, что нуклеотидная последовательность кодирует следующую аминокислотную последовательность:

НЕТ TRP GUI LEU THR SER LEU LEU LEU PilE VAL ALA THR TRP GLY ILE

SER GLY TJIR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE ЗЕЙ SER SER GLU ARG

ALA HIS GLN VAL LEU ARC ILE ARG LYS ARG ALA ASM SER PILE LEU GLU

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLH ASN VAL ASP ASP THR LEU

ALA PllE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GUI CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LE U CYS CYS GLY HIS GLY Tim CYS ILE

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARC SER GLY TRP GLU OLY

ARG Plffi CYS GLH ARG GLU VAL SER PilE LEU Rl CYS SER LEU ASP ASN

r

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARC ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLH CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARC PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP Tim GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET. THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PllE VAL HIS PRO R2 TYR SER LYS SER THR THR ASP ASH ASP ILE ALA LEU LEU HI

LEU ALA GUI PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

тромбомодулин, затем измеряли амидоли- тическую активность продукта путем гидролиза трипептидного субстрата S-2366

(полученного из лаб. Helena). Антикозгулиактивированного тромбопластина с использованием реагентов от лаборатории Helena.

Формула изобретения 1. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка.С, предусматривающий конструирование вектора, включающего область репликации, селективный маркер, промотор, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок С, о т л и- ч а ю щ и и с я тем, что нуклеотидная последовательность кодирует следующую аминокислотную последовательность:

451838411 46

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARC GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

T.

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARC GLU LYS CLU ALA

LYS ARC R3 ARO Tlffi Р1ГЕ VAL LEU ASN РКБ ILE LYS ILE PRO VAL VAL

PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL НЕТ SER ASN MET VAL SER GLU ASN

.. i- MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYSGLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRPPHE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HISASN TYR

GLY VAL TYR Tlffi LYS VAL SER ARG TYR LEU -ASP TRP ILE HIS GLY HIS

ILE, АЯО ASP LYS GLU ALA PRO GLNLYS SER TPJ ALA PRO-COOH

где R.1 - GLNiR2- ASM, Пз - ASN; R - ASN, 2. Способ получения зимогенмой формы

полученные в результате сайт специфиче-. белка С человека, включэкщий траксфорского мутагенеза фрагментов-ДНК плэзмиды.мацию эукариотической хозяйской клетки

рН PC-Q097 или pGT-Q097-h, или Ri -ASN,рекомбинантным пектором ДНК, содержаR2 - GLN, R2 - ASN, R4 - ASN, полученные в5 щим нуклеотидную последовательность, корезультате сайт специфического мутагенезадирующую аминокислотную

фрагментов ДНК плазмиды pLPC-Q248, илипоследовательность полипептидэ со свой-pGT-Q248-h, или RI - ASN, R2 - ASN, Ra - GLN,ствами белка С человека, промотор, стиму R4-ASN, полученные в результате сайтспеци-лирующий экспрессию ДНК,

фичсского мутагенеза фрагментов ДНК плаз-4 0 культивирование трансформированных клемиды pLPC-Q313 или плазмиды pGT-Q313-h,ток, выделение целевого продукта из кульили RI - ASN, R2 - ASN, RG - ASM, R - GLN,туры трансформированных клеток, отл и- ч

полученные п результате сайт специфическогоа ю щ и и с я тем, что аминокислотная

мутагенеза фрагментов ДНК плазмиды pLPO-последовательность имеэт следующий

. Q329 или плазмиды pGT-Q32.9-h.-{5 вид: MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PIffi VAL ALA T1LR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GUI VAL LEU ARC ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PIE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SЈR GLY TRP GLU GLY ARG PIffi CYS CLN ARG GLU VAL SER PHE LEU П1 CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PICE PRO CYS- GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP Tlffi GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO

TRP, GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA

VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SEH LYS LYS LEU LEU VAL ARC LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARC ARC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL РИЕ VAL HIS PRO R2 TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU. ALA GLN PRO ALA Tim LEU SER CLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU ;THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

LYS .AR. ARC THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN

MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER Plffi HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP tYS GLU ALA PRO GItN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

где Ri - GLN, R2 - ASN. Ra - ASN, RA -ASN группы следующих . клеток: 293/pL wmRi-ASN, R2-GLN, R3-ASN, R4-ASN, PS-Q097, . 293/pL PC-Q248, 293/pLPC- MflMRt-ASN.Rz-ASN, R3-GLN,R4-ASN, Q313, 293/pLPC-Q329, 293/pGT-Q097-h, или Ri-ASN. R2-ASN, R3 - ASN, R4-GLN. 293/pGT-Q248-h, 293/pGT-Q313-h и а трансформированную клетку выбирают из 5 293/pGT-Q329-h.

Таблица1

49

1838411

Клеткя-хозяин

Происхождение

HepG-2 CV-1 исход. LLC-MK2 LC-MK2 производное

ЗТЗ СНО-К1

Гепатобластома чел. Почка афр. зел. мартышкиПочка макак-резуза

ЭмОр. фибробласты

мыши

Яичник китайс. хомячка

Чел. шеечный эпителий

Миелома человека

Гепатома крысы

Мышиный

фибробласт

Клет. чел. Плазмоцитомы

ВМК-21

Почка-дитеныша хомячка

т А м е р и ка i i с л л е к ц и я типовых культур, 12301 Парклаун Драйв, Рокьилль, Мэриленд 20852-1776. Таблица 4

Определяли путем деления количестоа активированного белка С, определенного с помощью АРТТ-анализа на количество, определенное

с помощью амидолитического анализа.

Не определяли. Относительная амидолитич. активность по сравнению с нативным АРС, умноженная на относительную антикоагулирующую активность.

50 Таблица 2

Таблица 3

Источник

Примечание

АТСС # НВ 8065

ATGC # CCL 70

АТСС CCL7

TCC#CCL7.1

АТСС # CCL 92 АТСС#СС1 61

АТСС #CCL 2 TCC#CCL 155

ТСС# CRL 1600

Эта линия клеток

описана в патенте

США №4393133

Растет быстрее, чем

№CCL7ATCC Пролин-зависим.

Производи. СНО-К1, такие, как dhfr - про- извод. DXB11, могут быть генерированы из этого хозяина Секретирование легкой цепи 10G Я-типа

Производные, такие, как 8-азагуанин-ус- тойчивые FAZA хозяйск. клетки, могут

быть генерированы

из этого хозяина.

ATCC#CCL10

511838411

Функциональная активность (ед./мг)

Примечание. Первая цифра в скобках означает кратность увеличения активности по сравнению с HP С, происход. из плазмь. Число независимых проб (п) определяли с удвоением или утроением.

Hind ML

tui

Stul

Stul/Pvull Bel

pLPG-Q097

fyuz. 1

52 Таблица 5

Т а б л и ц-а 6

Bell

Pvull

Bel

Hindi

StuI

Stu

Stul/Pvull

Фиг. 2

Hindlll

StuI

StuI

Sttil/Pvull

Фиг.з pLPC-Q313

Bell

Pvull

Bel

EcxiRI

Bell

Pvuli

Hindi IГ

tul

Stui

PLPC-Q329

ФигЛ

BCII

Hindll

TPUMLP

BzmH Bglll

BamHI

Pvull

Bell

Stul/Pvull Bell Hindlll

BzmH Bglll

Bglll HintjIJ

pGTC

cpu 2. 5

Hindlll Bcli

Bglii

Hindlll

BamH

Bgilf

Bell Bglll Л jr Hindlll

BamHl EcoRI

BamHl Hindlll

Bglll Hindlll

Bglll

Aatll