Изобретение касается способа экс- прессии ДНК последовательностей, которыекодируют активности деацетоксицефалоспорин Ссинтетазы йде- ацетилцефалоспорин С синтетазы.
(DAOCS) катализируют реакцию, в которой из пенициллина IM образуется деацетоксицефалоспорин С (DACC). и очень часто рассматривается как экспандазэ (увеличитель обьема). Деацетилцефалоспорин С синтетаза (DACS) катализирует образование деацетилцефалоспорина (DAC) из DACC, реакция гидроксилирования. Эти реакции являются критическими этапами в биосинтезе очень важных антибиотиков, таких, как цефалоспорины, из Cephatosporium acremonium и 7 -метоксице- фалоспорины из Streptomyces clavuligerus.
Соединения ДНК, используемые в способе данного изобретения, кодируют DAOC и DACS в одиночной открытой рамке считывания. Транскрипция этой открытой рамки считывания с последующей трансляцией полученной информационной РНК (тРНК) приводит к получению одиночной полипегУтидной цепи, которая обладает как DAOC-, так и DACS-активностями.
Соединения ДНК, которые кодируют активности DACS/DAOCS, были выделены из геномной ДНК Cephalosporium acremonium.
Продуцирование E.coli активности DAOCS-/DACS катализируют образование DAOC из пенициллина Nu DAC и DAOC. Сырые клеточные экстракты этих трансфор- мантных E.coli по настоящему изобретению проявляют активности DAOCS/DACS без какой-либо предварительной активацион- ной обработки. Заявленный способ экспрессии в E.coli обеспечивает эффективное средство получения больших количеств активного фермента DAOCS/DACS. Этот фермент DAOCS/DACS полезен не только для продуцирования DAOCS и DAC. но также и для расширения спектра пенициллинов иных чем пенициллин N и для гмдроксили- рования цефалоспоринов иных чем DAOC для образования новых.
ДНК соединения, отвечающие настоящему изобретению, образованные от геномной ДНК Cephalosporium acremonium.
СО
00
to
00
4
шЛ
00
со
в высокой степени гомологичны в своей нук- леотидной DAOCS последовательности соединениям ДНК, кодирующим активность DAOC и/или DACS в других продуцирующих цефелоспорин организмах, таких как Streptomyces clavuligerl.es. Ввиду этой гомологии отвечающие настоящему изобретению соединения ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, могут быть мечены и использованы для отбора геномных библиотек организмов, которые продуцируют цёфалоспорин С или аналогичные соединения на присутствие либо ДНК, кодирующей DACS, либо ДНК, кодирующей DAOC. Многие организмы включают ДНК,.кодирующую активность DACS/DAOCS, которая может быть идентифицирована и выделена с использованием соединений ДНК, отвечающих настоящему изобретению.
Отвечающие настоящему изобретению соединения ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, были выделены в сочетании с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипцию и в конечном итоге выражение активностей DAOCS/DACS.
Настоящее изобретение включает также регуляторные сигналы гена DACS/DAOCS, расположенного у З -конца кодирующей области гена DACS/DAOCS Cephalosporium aeremonium. Эти 3 -%регуляторные последовательности кодируют транскрипционную терминацию и полиаде- нилирование тРНК, и сигналы процессикга гена DACS/DAOCS.
DAC-диацетилцефЗлоспорин С
ПН,
I I к
-S-NV-.
пХ i сн
COOK
DACS-деацитилцефалоспорин С синте- таза, ферментная активность, которая катализирует конверсию DAOC в DAC.
DAOC-деацетоксицефалоспорин С
ноос
ИНг ,
На фиг,1 показана рестрикционная и функциональная карта плазмиды р Т503; на фиг.2 - рестрикционная и функциональные карты, производные и взаимосвязь плазмид
pKENUJ (101), рВ R322(102) и .103, промежуточных плазмид в построении плазмиды pCZR336; на фиг.З - рестрикционная и функциональные карты, производные и взаимо- связь плазмид 103, 104 и 105,
0 промежуточных плазмид в построении плазмиды pCZR336; на фиг.4 - рестрикционная и функциональные карты, производные и взаимосвязь плазмид рКЕМ021 (106 и 107) и рКЕ (101), промежуточных плазмид в по5 строении плазмиды pCZR336; на фиг.5 - рестрикционная и функциональные карты, производные и взаимосвязь плазмид ptrp ED 50ch GH800 (108). pBR 322 (102 и PNM575), (109), промежуточных плазмид в
0 построении плазмиды pCZR 336; на фиг.6 - рестрикционная и функциональные карты, производные и взаимосвязь плазмид pNM 575(109), p.KEN021 (107) и pNM702 (pi 101), . промежуточных плазмид в по5 строении плазмиды pCZR336; на фиг.7 - рестрикционная и функциональная карта плазмиды pi 108, промежуточной плазмиды в построении плазмиды pCZR336; на фиг. 8 - рестрикционная и функциональ0 ные карты, производные деривитизации и взаимосвязь плазмидpL110, pL110A. и pL110C и бактериофагов m13 и гпр18, ггИЗТсЗи pL1108, промежуточных векторов в построении плазмиды pCZR336;
5 на фиг. 9 - рестрикционная и функциональная карта плазмиды plTlGO; на фиг. 10 - рестрикционная и функциональная карта плазмиды pCZRUJ; на фиг. 11 - рестрикционная и функцио0 нальная карта плазмиды pCZR336; на фиг.12 - рестрикционная и функциональная карта плазмиды .
Последовательность ДНК гена 45 DACS/DAOCS (гена экспандаза/гидро- лиза)
51838413 6
290 300 310320 330
. гт тел ;лл ест ттс г; IT стс лет GGG АТС что тел лтс стт ллл
340}50 360 370 ЭНО ТТС СТО TTG С,С, АЛС ТТГ ГГ.Т ССЛ ССС Т АС ТСС ТСТ СЛА (ПС ЛТС ОСТ .20 , 4ои ./,10 42.0 430 СЛЛ АЛС CAC ЛСС ЛТС МС Л ГС ЛСТ ТСС АЛО С-ТС ССС GTC ТТТ CGT СТС
«ИТ TliR SOR LYS VAL PRO VAL THE ARC LEU
5 - . 10
440 450 460470
25 GAC СЛС СТС АЛО ЛСС CGC ЛАС GTC СТС АСС СЛС СТС ССС GAG GCC GTC . , ASP ASP LEU LYS SKR GLY LYS VAL LEU TJIR CLU LEU ЛГ.Л GLU ALA VAL
15 . ... 2025 480 490 500 510 . 520 АСС АСС АЛО GG f АТС ТТС ТЛС TTG АСС GAG AGC GGC CTG GTC GAC GAC
30тик THR LYS GLY-.II.E PIIE-TYR LEU TI IR GLU SER GLY LEU VAL ASP ASP
3035 40
530 540: 550 . 560 570 GAC CAC ACC TCG CC G CGT GAG ACG TGC GTT GAC TTT TTC A.AG Л AC OGA ASP HIS THR SER ALA Alffi CLU ТИК CYS VAL ASP PltE PHE LYS ASN GLY p45 50 55
5805(JO 600 610 620 AGC.GAG GAG GAG AAG AGG GCC GTG ACG CTC GCC GAC CGT AAC GCC CGC SER GLU GLU GLU LYS ARC ALA VAL THR I.EU .-ALA ASP ARG ASN ALA ARC
6065 70
40 630 640 650 660 670 CGC GGC ТТС ТСТ. GCC CTC GAG TGG GAG AGC ACC GCC GTC GTC ЛСС GAG ARG GLY PHE SER ALA LEU GLU TRP GLU SER THR ALA VAL VAL THR GLU 75 80 -85 40
680 690 700710 45 ACG GGC AAG TAG TCG СЛС ТЛС TCG ACG TGC T.AC TCC ATG .GGC АТС GGC
THR GLY LYS TYR SER ASP T.YR:SER THR CYS TYR SER MET GLY ILE GLY 95100 105
X-7188 /20 730 . 740 75.0 ; 760
GGC ЛАС CTG TTC CCG ЛАС СССЗ GGC TTC GAG GAC GTC TGG СЛС GAC, ТЛС GLY ASH LEU PHE PRO ASH ARC; GLY PHE GLU ASP VAL TRP GDI ASP TYR
110 : 115 120 5 /70 . 780 7 JO800 810
TTC GAC CGC ATG TAC GGC CCA GCC AAG GAT GTC CCG CGC CCC GTT CTC PHE ASP ARG MET TYR .CLY AU ЛГ.А I.YS. АГ,Р VA.L ЛТ.Л AfJG Al A VAL I.flU
125130 . 135 &2Q 830 8-.0 . 850 ° 10 AAC TCT GTG GGC GCC CCC, CTC GCC. liOG GAG GAC ATT СЛТ Г.АС TTC GTC ASH SER VAL GLY ALA PRO LEU АГ.А CLY GLU ASP ILE ASP ASP PHE VAL 140 I4:i - . 150
870 H80890 900 910 GAG TGC CAT CCC CTC CTC CCC СТА CGG TAG TTC CCC СЛЛ GTG CCG GAG ;5 GLU CYS ASP PRO LEU LEU ARC LEU ARG TYR PHE PRO GLU VAL 1 RO GLU . 155 160«, 165 I /O - . J20 930 940 J-SO
GAC CGC GTC GCC GAA GAG САД CCC CTC CGC ATG GGA CCC CAC TAG GAC J ASP ARG VAL ALA GUI GLU CLU PRO LEU ARG MET GLY PRO HIS TYR ASP 20 175 180 18S
960 970 980 990 .1000 СТА TCG ЛСС ЛТС ACG CTC GTG СЛС CAG-АСА GCC TGC GCC AAC GGC TTC LEU SER THR П.Е THR LEU VAt HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY PHE 190195 200
25 1010 1020 1030 1040 1050 . GTG AGC CTG CAG TGC GAG ПТС GAC GGA GAA TIC GTC GAC i.TC CCG ACG VAL SER LEU (H.N CYS GLU VAI. ASP GI.Y GI.U PHE VAL ASP l.EU PRO THR
2052)0 215
. .1060 1070 1080 1090 1100 30 CTC CQG GGC GCC ATG GTC GTC TTC TGC GGC GCG GTC GGC ЛСС CTG GCC .LEU PRO GLY ALA MET VAL VAL PIIE CYS GLY ALA VAL GLY THR LEU ALA 22022) . 230
1110 1120 ИЗО 1140 1150 ACG GGC GGC AAG GTC AAG GCG CCC AAG CAC CGG GTC AAG TCT CCC GGG 35 THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA-PRO LYS HIS ARG VAL. LYS SER PRQ GLY 235240 245 A 250
1160 11.70 . 1180 1190
CGC GAC CAG CGC GTC GGC AGC AGG CGC ACG TCG AGC GTC TTC TTC CTG ARG ASP GLN-ARG VAL GLY SEN SER ARC TIIR SER SER VAL PIIE PHE LEU 40 260 265
1200 1210 1220 1230 1240 CGG CCG AAG CCC GAC TTC AGC TTC AAC GTG CAG CAG TCG AGG GAG TGG ARG PRO LYS PRO ASP PHE SEK PIIE ASH VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP
270275 280 45 1250 1260 1270 1280 1290
GGT TTC AAC GTC CGC АТС CCU TCG GAG CGC ACG ACG TTC AGG GAG TGG GLY PHE ASN VAL ARC ILE PRO SER GLU.ARG TIIR THR PHE ARG GLU TRP 285290 . , 295
Использование: /енетич еская инженерия, рекомбинантная технология получения ферментов. Сущность изобретения: способ экспрессии DACS/DAOCS активности в клетках E.coli предполагает трансформа- цию штамма E.coli K12 Im109 плазмидой с последующим отбором клонов, экс- прессирующих данную активность. 12 ил.
X-7188
1300 1410 . 1320 1330 1340 CTT GGC GGG AAC TAT- GTC AAC ATG COG AGG C/T AAG CCG GCG T,CA GCG I.KU GLY GLY ASM TVR VAL ASH НЕТ ARG AKG ASP LYS PRO ALA ALA ALA
.300305 310
51350 136.0 1370 1380 1390 GAG GCG GCT.GTC CCC tX G CCT GCC CCT GTC TCT ACC GCA GCT CCT ЛТЛ GI.U ALA ALA VAL PKO AI.A ALA ALA PRO VAL SER THR ALA ALA PRO ILE 315 . : .320 . : 325 330
14001410 1420 1430
10 M-C ACT TAG C-GA ACC CGC СПА TCG ACT ЛАТ AAA TCT ACG CGA GTT ТЛА ALA THR
H iO1450. . . 1460 1470 1480 GAA GAA AAA TTG/CCC TAT AAA T.TG СТА AAT TTT ТАЛ ЛАС АСА AAG CAT
14901500 1510 i5 GAG TGT СЛА GAG TTT CAA CTT TCA A-3
где A - деоксиаденил; G - деоксигуанил;цистеина; GLN - группа глутамина; GLU С - деоксицитидил; Т - тимидил; ALA -группа глутаминовой кислоты; GLY группа аланина; AGR - группа аргинина,группа глицина; HIS - группа гистидина;
ASN - группа аспарагина; ASP - группаILE - группа изолейцина: LELJ - группа
аспарагиновой кислоты; CyS - группалейцина; LYS - группа лизина; МЕТгруппа метионина; РНЕ - группа фенилала- нина; PRO - группа пролина; SER - группа серима; THR - группа треонина: TRP - группа триптофана; TYR - группа тирозина: VAL - группа валина.
Показанная последовательность ДНК содержит примерно 63% G и С и кодирует полипептид с рассчитанным молекулярным веЈом 36, 462 дальтон и измеренным молекулярным весом 40.000 дальтон.
Указанная последовательность может быть синтезирована обычным образом путем модифицированнго фосфоротриэфир- ного способа с использованием полностью защищенных деоксирибонуклеотидных блоков. Такие способы синтеза хорошо известны и могут осуществляться в соответствий -с методикой Stakura и др., -1977г. Science 198:1056 и с методикой и др., 1978 г., Ргос. Nat. Acad. Scl., USA/США, 75, 5765. Кроме того, особенно предпочтительный спб.соб описан в работе Hsiung и др., 1963 г., Nucleic Acid Research 11, 3227 и в работе Магапдидр., 1980г., Methods in Enzymology 68. 90. Кроме способов, описанных в справочных руководствах данная последовательность ДНК может быть синтезирована в автоматизированном синтезаторе ДНК, таком как Systec 1450A или ABS (Applied BiQsystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, XA 94404) 380A, синтезаторы ДНК.
Ввиду вырожденности генетического кода, который является результатом наличия более чем одного кодона для большинства аминокислотных групп и трансляционного стоп-сигнала, последовательность аминокислот указанного фермента DACS/DAOCS может быть кодирована множеством других последовательностей ДНК. Так как эти альтернативные последовательности ДНК будут кодировать ту же последовательность аминокислот, отвечающую настоящему изобретению, то данное изобретение будет охватывать также и эти альтернативные последовательности и способы, в которых используются эти альтерна- тийные последовательности.
Ввиду различного числа видов Cephalosporium и даже различных штаммов в пределах одного вида существуют генети- ческие .варианты ДНК, кодирующей DACS/DAOCS, отвечающей настоящему изобретению. Эти генетические варианты включают основные последовательности ДНК и аминокислоты, гомологичные соединениям, отвечающим данному изобретению, и кодируют белки с аналогичной,если не полностью идентичной, активностью, но несколько отличаются от фактических соединений, отвечающих данному изобретению. Эти генетические варианты эквиваленты также соединениям, отвечающим насто- ящему изобретению, и могут использоваться в способах данного изобре- 5 тения.
Отвечающие настоящему изобретению соединения ДНК, кодирующие активность DACS/DAOCS, выделены из штамма Cephalosporium acremonlum, общеизвестного как штамм Brctzu, который имеется в коллекции культур американского типа, Роквилл. Мерилэнд, где он хранится под номером АТС 11550. Геномная библиотека общей геномной ДНК штамма Brotc U была
5 построена в бифункциональном космидном векторе pKCz462A (существующим в E.coll .. К12 под номером NRRL В-15973) и была исследована на наличие последовательностей, гомологичных ряду из 32 различных
0 деоксирибоолигонуклеотидов. Этот ряд различных деоксирибоолигонуклеотидов был построен согласно информации, полученной от частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonlum
5 DACS/DAOCS и на основе знания этого генетического кода. Были идентифицированы различные векторы, которые гомологичны одному или нескольким из 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов. Последonл0 цельность ДНК раскрывает, какие векторы кодируют фермент С. acreinoriium DACS/DAOCS.
. После идентификации векторов, которые кодируют фермент DACS/DAOCS, был
. BamHI, включающий ген DACS/DAOCS ион
был вставлен в коммерчески доступную
плазмиду риС8, образуя плазмиду ,
которая затем трансформируется в клетки
0 хозяева К12 IA221. Эти трансформанты E.coli K12 1А221/р1Т503 были депонированы и составили часть коллекции культуры Се- ,- верной региональной научно-исследовательской лаборатории (NRRL) Пеория, IL
5 61604, под номером NRRL B-18170. Рестрик- ционная и функциональная карта плазмиды . представлены на фиг.1.
Плазмида PIT503 может быть выделена 0 из E.coli K12 IA221 способом, описанным в примере 1, и используется в качестве исходного материала для построения плазмиды р|Т507, которая обеспечивает высокую степень выражений активности DACS/DAOCS 5 в E.coli. Порядок проведения операции для построения плазмиды представлен в примере 2 (смотри 2К), и включает сшивку кодирующего 2,2 KB Sstl-BamHI DACS/DAOCS рестрикционного фрагмента плазмиды р1Т503 с 5,8 KB NDel-BamHI фрагментом плазмида pCZR336 и синтезированным фрагментом 60 bp SstT-Ndel.
Плазмида pCZR336 включаетАр промотор, трансляционную активирующую последовательность, оператор с 1857, первую функциональную единицу наследственности (пистрон), кодирующую небольшой пептид, который предшествует представляющему интерес гену, и последовательность ДНК, кодирующую производное LGH (гормон роста человека). При низкой температуре, составляющей примерно 30°С, белок, экспрессируемый с использованием плаз- мид pCZR336 и , является активным и способен подавлять активность промотора ApL, но при повышении температуры примерно до 42°С белок с 1857 инактивируется, промотор инициирует транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей LGH (p.CZR336) или ЦАСЗ/DAOCS (). Ре- стрикционная нефункциональная карта плазмиды pCZR3lfe представлены на фиг.2. Плазмида включает тот же первый цистрон с 1857 ген; промотор ApL и трансляционную активирующую последовательность, что и плазмида pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена DA.CS/DAOCS от плазмиды вместо кодирующей последовательности LGH. Рестрикционный фрагмент - 2,2 кв Sstl-BamHI плазмидЧй включает большую часть кодирующей последовательности DACS/DAOCS; остальная часть этой кодирующей последовательности содержится в синтезированном фрагменте 60 bp Ndel-Sstl с небольшой модификацией последовательности ДНК дикого типа, что облегчает последующую работу. Распознавательная последовательность рестрикци- онного фрагмента Ndel, которая представляет собой
б -САТАТС-З .....
МП II
3 -GTATAC-5 включает 5 -АТС-3
З-ТАС-5 , которая кодирует амино- терминальную метионильную группу DACS/DAOCS. Плазмида построена таким образом, что промртррАр и трансляционные активирующие последовательности расположены так, что вызывают экспрессию ДНК, кодирующую DACS/DAOCS. Рестрикционная и функциональная карта плаэмиды представлены на фиг.12. В примере 2 описывается построение плазмиды более подробно,
При температуре примерно 42°С E.coll К12 1М109/р1Т507 выражает высокий уровень активности DACS/DAOCS, приближающийся к 15% от общего клеточного
белка. Сырые клеточные экстракты от этих трансформантов E.coti K12 IM109/plT507 способны катализировать конверсию пенициллина N в DAOC и DAC, в то время как клеточные экстракты от нетрансформигя)0 ванных клеток E.coli K12 IM109 не могут катализировать эту конверсию. Данный способ анализа и результаты анализа реакции конверсии представлены в примере 3. Многие штаммы E.coii К12 включают эк5 тивность эндогенной цефалоспориназы, вероятно, кодированной локусом атрС. По этой причине желательно осуществлять частичную очистку полипептида DAOCS/DACS таким образом, чтобы дости0 галась оптимальная активность DAOCS/DACS. Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕ-три- вакрила для отделения активности эндогенной E.coii цефалоспориназы от желаемой
5 активности DAOCS/DACS. Пример такого типа частичной очистки описан в примере 3. Другой возможностью использования частичной очистки для исключения вредных влияний цефалоспориназы является ис0 пользование штамма, дефектного в продуцировании данной активности. Один такой штамм E.coii K12 А85892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером
5 NRRLB-18096,
Плазмида является эффективным средством продуцирования больших количеств DACS/DAOCS в E.coii. В виду того что E.coii plT507 продуцирует
0 DACS/DAOCS в количествах, приближающихся к 15% от общего клеточного белка, и ввиду того что культивация E.coii менее сложна, чем культивация организмов, которые естественно продуцируют DAOCS
5 и/или DACS, трансформанты E.coii plT507 могут быть использованы в способе продуцирования DACS/DAOCS после эффективно и более экономично, чем естественные продуценты DACS/DAOCS.
0 DAOCS может быть использована для продуцирования DAOC из пенициллина N в свободной от клеток системе, как описано в примере 3. DAOC является не только полезным антибиотиком, но также может быть
5 использована в качестве исходного материала для продуцирования таких важных антибиотиков как цефэлексин и другие цефалоспоринм (см. патент США № 4307192). Другим очень важным использованием DACS/DAOCS является использование фермента для трансформации пеници,-.- линов иных чем пенициллин N в новые це- фалоспориновые производные,
Плазмида особенно предпочтительна для обеспечения экспресии DACS/DOCS в E.coli не только ввиду высоких уровней этой экспресии, достигаемых при использовании данной плазмиды, но и ввиду отобранного маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы рекомбинантной ДНК кодируют / -лактама- зу таким образом, что клетки, содержащие этот вектор, могут расти в присутствии некоторых Д-лактамовых антибиотиков, таких
как ампициллин. Однако если желательно использовать свободный от клеток экстракт, содержащий DACS/DAOCS для целей по- строе ния / -лактамов, то нежелателен экстракт, который содержит активность / -лактамазы. Так, плазмида не коди- рует /2-лактамазу в качестве маркера, и использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, который не реагирует с / -лактамами.
Способ экспрессии DACS/DAOCS и относящийся к нему вектор, отвечающий настоящему изобретению, не ограничиваются определенным отобранным маркером. Специалисты в данной области знают, что многие маркеры пригодны для использования , на векторах экспрессии DACS/DOCS, Такие маркеры представляют гены, которые придают резистентность к канамицину, хлорам- фениколу или к другим антибиотикам.
Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Культура E.coli K12 1А221/рт503 и выделение плазмиды .
Лиофил E.coli K12 1А221/р1Т508 был получен из Северных региональных научно- исследовательских лабораторий, Неория, шт.Иллинойс, который имеет порядковый номер NRRL В-13170. Этот лиофил был непосредственно использован как культура в описанной ниже процедуре.
1 л питательного бульона L(10 г трип- тона, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащего 50 мкг/мл ампицил- лина, инокулировали культурой E.coli.
Клеточные осколки удаляли из раствора путем центрифугирования при вращении центрифуги со скоростью 25000 об/мин в течение 40 мин в роторе SW27 (Beckman, 7360 N. Lincoln Ave, Lincolnwood, Jl., 60646). Поверхностный слой экстрагировали буферным фенолом. В этот раствор вводили примерно 30,44 г CSCI и 1 мл раствора этилбромида концентрацией 5 кг/мл, затем этот раствор доводили до обьема 40 мл и
декантировали в ультрацентробежную трубку (Бекмэна) VTiSQ. Эту трубку герметически запаивали, раствор центрифугировался в роторной центрифуге VTi 50 при скорости 5 центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч, Полученная плазмида, визуализированная ультрафиолетовым светом, была выделена и затем помещена в трубку TI75 и роторную центрифугу (Бекмана). где осуществлялось
0 центрифугирование со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч. Любое необходимое регулирование обьема осуществлялось с использованием раствора TES, содержащего 0,761-г/мл CSCI. Затем плазмидная полоса
5 снова выделялась, экстрагировалась насыщенным солью изопропанолом с целью уда- ления этилбромида и разбавлялась (1:3) буферным раствором TES. В раствор иьиди- ни 2 обьема этанола и затем его нчкуР-т--1
0 вали при -20°С в течение ночи. Плазмида ДНК,гранулировалась путем центрифугирования данного раствора а роторной центрифуге SS34 (Sen/all) n течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 об/мин.
5ДНК плазмиды plt503, полученная таким образом, 1 мг суспензировэпась в м. буферного раствора ТЕ (10 ммоль Трис-НС, рН8и 1 ммоль ЕДТА) и хранилась при -20°С. Рестрикционная функциональня
0 плазмиды представлены на фиг. 1.
П р и м е ,р 2. Построение плазмиды рГГ507.
А. Построение плазмиды pKEN021 и выделение ее рестрикционного фрагмента
5 5,1 KsXbal-BamHI.
В данном разделе примера описывается выделение рестрикционного фрагмента 5,1 KBXbal-ВатНГплазмиды pKEN021 (106 на фиг.4). Плазмида pKEN021 получена от
0 плазмиды pKENLU (101 на фиг.2 и дополнительное описание приведено в работе Lee и др., 1981 г,, 146, 861-866. и Lwiebel и др., .1981, I. Bact. 145:654-656). Плазмида pKENLU могла быть получена из Северного
5 регионального научно-исследовательского центра (NRRL), служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Иллинойс, 61604, E.coli CC620, порядковый -номер NRRL15011.
0 Плазмидл pKENHI имеет рестрикцион- ный фрагмент 2,8 кб EcoRI, который включает ген E.coii pp см. Nakamura and Jnouye 1979 г., Cell 18. 1109-1117).
В плазмиде pKEN021 рестрикционный
5 фрагмент 650 п.о. EcoRI-Sall плазмиды рВ 322 был заменен, генной последовательностью E.coli Ipp. Эти генные, последовательности Ipp включают фрагмент 462 (Alu), расположенный перед первым триплетом кодирующей последовательности Ipp. Этот
фрагмент 462 п.а., содержит промотор, 5 нетрзнслируемую зону и сайт, связанный с рибосомой.
Уникальный рестрикционный сайт Xbal расположен в пределах сайта связывания с рибосомой в 16 п.о. передтрансляционным- инициирующим метиониновым колоном. Сайт рестрикции PVUH, находящийся .на 105 п.о. выше от трансляционного концевого кодона кодирующей последовательности Ipp, заменен на сайт рестрикции BamHI путем ввода синтезированной связующей молекулы ДНК (5 -CCGGATCCGG-3 Collaborative Research inc., 128 Spring Street, Lexlngton, Maccaryceme 02173). Ко- дирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность, соответствующая 3 нетранслируемой зоне информационной РНК, следует за сайтом BamHI, ПлаэмидарЕМ021 включает также некоторые независимые последовательности на 850 п.о., расположенные ниже гена Ipp в хромосоме E.coli.
Как показано на фиг.2-4, плазмида pKEN021 образована от плазмиды рКЕМШ следующим образом. Примерно 50 мкг плазмиды pKEN (101 на фиг.2) рестрицировалась 25 единицами фермента Hpall (если нет других оговорок, рестрикционные ферменты и определения единиц соответствуют New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverl.y, Maccarycemc 01915) в 300 мкл буферного раствора IX Hpal (10 ммоль, Трис. HCI, рН 7,4; 10 ммоль MgCI ммоль КС1; и 6 ммоль /J-меркаптоэтанола) при 37°С в течение 2 ч. Смесь экстрагировалась двукратно 300 мкл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50, извлеченная водная фаза повторно осаждалась 2,5 объемами этанола и 0,1 объемом 3 моль, адектата натрия (NaOAc). Гранула ДНК растворялась в 100 мкл элект- рофорезного буферного раствора и фракционировалась на 5% полиакриламидном геле (соотношение акриламид:бис составляло 29:1 во всех полиакриламидных гелях за исключением тех сдучаев, где оговорено особо). Этот гель окрашивался в растворе, содержащем 0,5 мкг/мл этилбромида, и ви- зуализировалась ДНК полоса в длинновол- новом ультрафиолетовом свете, Ограничительный фрагмент 950 op Hpall был изолирован и извлечен из геля путем электроэлюирования в диализный мешок. После экстракции смесью фенол /СНСЛз и осаждения этанолом извлеченная ДНК (2,5 мкг) растворялась в 25 мкл TEN (10 ммоль NaCI; 10 ммоль трис, HCI, рН 7,4 и л ммоль натрийэтилендинитролететраацетат(ЕДТА).
Примерно 2 мкг фрагмента 950 п.о. Hpall переваривалось рес.трикционным ферментом Alul в 200 мкл буферного раствора IXAlul (50 мМоль NaCI; 6 мМоль Трис. HCI, рН 7,6; 6 мМмоль MgCte; 6 мМоль /3-меркап- тоэтанол) в течение 2 ч при 37°С. ДНК фрак- ционироваласьна 6%-ом полиакриламидном геле и фрагмент462 Alul извлекался и очищался как описано выше. Фрагмент 462 bpAlul ( 1 мкг) растворялся в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы (66 мМоль Трис, HCI, рН 7,6; 10 мМоль MgCI 10 мМоль дитиотрентол и 0,4 мМоль АТР), содержащего 150 пикомолей фосфорилиро- ванного связующего звена EcoRI (5 -GG- ААТТСС-3 из Collaborative Research) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы. После инкубации при 4°С в течение 16 ч смесь нагревалась при 65°С в течение 10 мин и затем разбавлялась до 100 мкл таким образом, что имела состав буферного раствора IX EcoRI (100 мМоль трис. HCI, рН 7,2; 50 мМоль NaCI; 10 мМоль MgCI. и б.мм оль1 /3-меркаптоэтанол), содержащего 40 ед. фермента EcoRI. По прошествии 2 ч выдержки при 37°С образец экстрагировался смесью фенол/СНС з и осаждался этанолом. Затем-ДНК растворялась в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы, содержащего Т4 ДНК лигазу и 0,1 мкг обработанной щелочной фосфэтазой, вываренной с EcoRl плазмиды pBR322 (102 на фиг.2). После сшивки при 4°С в течение 16 ч полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом (Е. Colt K12 НВ101 NRRL-15626). Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции, как описано в работе Birnboim and Doly, 1979 год. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523. Была выбрана плазмида (103 на фиг.2), содержащая фрагмент 466 bp Xbal- Bam HI и использование в качестве исходного материала для следующего описанного этапа.
Примерно 2 мкг этой плазмиды (103 на фиг.3) расщеплялось 2 единицами фермента Hind 111 в 50 мкл буферного раствора IX Hind III (60 мМоль NaCI; 10 мМоль Трис. HCI, рН 7,4; 10 мМоль MgCb и 6 мМоль / -меркепто- этанол) в течение 1 ч при 37°С. После того как реакционная смесь экстрагировалась смесью фенол/СНС з и осаждалась этанолом, ДНК растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеазы IX (300 мМоль NaCI; 30 мМоль NaOAc, рН 4,25; и 3 мМ-оль ), содержащего 200 единиц нуклеазы SI (Miles Laboratories 30 W. 475, N.Aurora Road, Naperviile, Jll. 60566). По прошествии 1 ч
выдержки при 15°С реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС1з и ДНК осаждалась этанолом. Вываренная с Hind 111, обработанная нуклеазой ДНК растворялась в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы, содержащего 20 пикомолей фосфорилированных связующих звеньев Bam HI (5 -CCGGATCCGG-3 из Collaborative Research) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После 16 ч выдержки при 4°С реакционная смесь нагревалась при 65°С в течение 10 мин с целью инактивации лигазы и затем разбавлялась до 100 мкл с целью получения буферного раствора IX Bam HI (150 мМоль NaCl; 20 ММоль Трис. НС1,рН8,0; ЮмМоль MgCl2 и 6 мМоль меркаптоэтанол). содержащего 20 единиц-фермента Bam HI. После 2 ч выдержки при 37°С смесь подеергалэсь.очист- ке на 1%-ом агарозном геле. Этот ге.-.ь окрашивался зтилбромидом, и более крупный фрагмент ( 4,5 кв) извлекался путем вырезания полосы этого фрагмента из геля, элюирования этого фрагмента после замораживания агарозного кремнезема и последующей очистки путем экстракции смесью фенол/СНС з и осаждения этанолом. Желаемый фрагмент может быть также выделен из агарозного геля с использованием мемб- . раны NA45(Schleicherand SchuelS) согласно рекомендации изготовителя.
Извлеченный фрагмент имеет липкие концы и его растворяли в 20 мкл буферного раствора лигазы Т4 ДНК, содержащего ли- газу Т4 ДНК. По прошествии 16 ч выдержки 4°С ДНК использовалась для трансформации Е. coli K12 НВ101 (NRR Ц8-15626). Трансформанты отбирались на стойкость к ампициллину (ApR) при 100 мкг/мл и на чувствительность к тетрациклину(TeS) при 10 мкг/мл. Некоторые плазмиды, полученные согласно описанию Birnboim из колоний ApR TcS, исследовались на отсутствие сайта Hind III и на присутствие единственного сайта Bam HI. Последовательное расщепление EcoRI, Sail приводило к образованию дсух меньших фрагментов, размером 466 п.о. и 305 п.о. и значительно более широкого фрагмента. Была выбрана плазмида(104 на фиг.З) с.этими характеристиками, затем она была модифицирована для превращения сайта EcoRI, расположенного выше пр.омо- тора Ipp, в сайт Hand III.
Эта модификация сопровождалась первым частичным расщеплением 2 мкг плазмиды (104 на фиг.З) в 100 мкл буферного раствора IX EcoRI с ферментом EcoRI. Реакция прекращалась при инактивации нагреванием при 65°С и экстракции смесь фенол/СНС1з реакционной смеси, осуществлялось осаждение ДНК этанолом. Гранула
ДНК растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеазы IX, содержащего 1000 ед/мл нуклеазы SI, и инкубировалась при 12°С в течение часа. Реакция прекращалась путем
экстракции смесью фенол/СНС з и ДНК осаждалась этанолом. Гранула ДНК снова суспензировалась в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного связующего
звена Hind III (5 -ССААССТТСС-5 , (из Collaborative Research) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы.
После 16 ч выдержки при 4°С смесь нагревалась в течение 10 мин при 65°С, раз5 бавлялась до 150 мкл с получением композиции буфера IX Hind Ш,содержащего 10 единиц фермента Hind III, инкубировалась в течение 2ч при 37°С и затем фракцио:;проаалаи
1
Самая крупная полоса (эквивалентная линейной полной длины плззмиде) извлекалась обычным образом, очищалась, растворялась в 20 мкл буферного раствора Т4 лигззы, содержащего лигазу, иякуПпровалась в течение 16ч при 4°С и использовалась для трансформации Е. coli HR101 (NRR LB-15626). Трансформант ApR, содгр- жащий плазмидную ДНК, анализп-ропа/ ся посредством рестрикционного анализа Бы;1а отобрана млазмида (105 на фиг.З) с фрагментом 500 вр EcoRI-Hlr.d III. Эгэ плазмида затем была использовано кзк вектор клонирования зоны 3 гена Ipp.
Примерно 2 мкг этой плазмиды (105 па
фиг.) вываривалось в 50 мкл буферного раствора IX Sail (150 мМоль NaCl; б мМоль Трис HCI, рН 7,9; 6 мМоль 6 мМоль / -мер- каптоэтанола) с 2 единицами фермента Sail в течение 1 ч при 37°С. Затем реакционная
смесь разбавлялась до 150 мкл с получением композиции буферного раствора Bam III, содержащего 2 единицы фермента Bam HI. После 1 ч выдержки при 37°С добавляли примерно 2,5 единицы щелочной фосфатазы, смесь инкубировалась при 65°С в течение 1 ч. Данный продукт экстрагировался смесью фенол/СНС1з, осаждался этанолом, растворялся в TEN и использовался как вектор клонирования для фрагмента Ipp 3.
Для получения фрагмента Ipp3 10 мкг плазмиды рКЕ (101 на фиг.2) расщеплялись в 200 мкл буферного раствора IX нРа, со- держащего 10 единиц фермента Hpal, в течение 2 ч при 37°С. После экстракции
смесьюфенол/СНС1зиосаждения этанолом ДНК растворялась в 10 мкл буферного раствора лигазы Т4 ДНК, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного связующего звена Sail (5 -GGTCGACC-3 из Collaborative Research и Т4 ДНК лигазу, затем инкубировалась в течение 16 ч при 4°С. Лигаза инак- тивиропалась путем нагревания при 65°С в течение 10 мин. Полученный материал разбавлялся до объема 100 мкл и в результате получалась композиция буферного раство- 5 ра IX, содержащего 10 единиц фермента Sal и инкубировался в течение 1 ч при 37°С.
Реакционна смесь разбавлялась до 300 мкл, в результате получалась композиция буферного раствора IX Pvuil (GO мМоль ю NaCI; 6 мМоль Трис. HCI, рН 7,5,6 мМоль MgCla; 6 мМоль /J-меркаптоэтанол). содержащего 10 единиц фермента P.vull. По прошествии 1 ч выдержки при 37°С ДНК фракционировалась на 5%-ом полиакрила- 15 мидном геле. Примерно 0,5 мкг фрагмента S50 п.о. извлекалось, очищалось и растворялось в TEN.
0,2 микрограмма этого фрагмента разбаолялись в 20 мкл буферного раствора 74 20 ДНК лигазы, содержащего 20 никомолей фосфорилированного связующего звена Bam HI (S -CCGGATCCGG-З1, из Collaborative Research) и.2 единицы Т4 ДНК лигззы, затем инкубировались в течение 25 16 ч при 4°С. Полученная ДНК затем нагревалась в течение 10 мин при 65°С, разбавлялась до объема ТОО мкл с образованием композиции буферного раствора IX Bam HI, содержащего 20 единиц фермента Bam HI, 30 инкубированного при 37°С в течение 2 ч, затем фракционировалась на 5%-ом поли- экриламидном геле с целью удаления избытка связующих молекул.
Полученный в результате фрагмент 950 35 п.о. с липкими концами Bam HI и Sail очищался обычным образом и растворялся в 20 мкл,буферного раствора Т4 ДНК лигазы, содержащего 0,2 мкг обработанной JBamlll- Sall плазмиды 105 и Т4 ДНК лигазы , После 40 инкубации к течение 16ч при 4°С ДНК ис- пользовалась для трансформации E.coli K12 НВ101 (NRR LB-15626).
Были получены плазмиды из трансформанта ApR и 5ти плпзмиды анализировались /15 на наличие фрагмента Sail-Bam HI. Желаемая плазмида ( 5,2 кв) была обозначена PKEN021 (106 из фиг.4).
10 мкг плазмиды pKEN021 расщеплялись при 37°С в 200 мкл буферного раствора 50 Bam HI, содержащего 10 единиц каждого из ферментов Вапт Xbal, в течение часа при 37°С. Желаемая ДНК, обработанная Xbal-Bam HI, затем обрабатывалась 2,5 единицами щелочной фос.фатазы в течение 1,5 55 ч при 65°С, экстрагировалась смесь фенол/СНС з, извлекалась путем осаждения этанолом и растворялась в 50 мкл TEN для последующего использования (107 на фи г. 4).
В. Построение плазмиды pNM575,
Плазмида ptrp ED50 chGHBOO (108 на фиг.5), описанная Martial и др., 1979 г., Science 205:602-607, использовалась в качестве источника ДНК, содержащей часть кодирующей последовательности nGH. Этот фрагмент мог быть построен методом синтеза или мог быть получен путем использования метода распознавания,описанного Goodmon и др,, 1979 г. Методы в знзимоло- гии, 68, 75-90,путем изоляции мРНК, кодирующей LGH, из слизистых оболочек человека. Часть LGH плазмиды pirp EDSOch GH800 содержит уникальный сайт рестрикции на 6 п.о. ниже трансляционного концевого кодона данной кодирующей последовательности. Этотсайтбыл заменен на сайт Bam III как описано ниже.,
Примерно 6 мкг плазмиды ptrp ED50 chGHSOO обрабатывалось 6 единицами Smal в 200 мкл буферного раствора IX Srna (15мМольТрис. HCI, рН 3,0; 6 мМоль MgCi2,- 16 мМоль KCI; 6 мМоль/ -меркаптоэтанбл) в течение 1,5 ч при 37°С. После полного вываривания осуществлялась экстракция смес- вью фенол/СНС з, ДНК извлекалась путем осаждения этанолом и затем растворялась в 24 мкл TEN 40 пикомолей фосфорилированного связующего звена Bam HI (Collaborative Research), вводили в 0,5 мкг (0,2 микомоля концов) обработанной как указано выше плазмиды о 16.мкл буферного раствора лигазы, содержащего Т4 ДНК ли- газу. Смесь инкубировалась в течение 2 ч при 22°С, в течение 16 ч при 4°С и затем в течение 10°мин при 65°С. Липкие концы Bam HI образовывались путем обычной обработки ферментов Bam HI. Данный фермент расщеплял последовательность линкера, а также сайт Bam HI. расположенный в начале клонированной LGH ДНК последовательности. Данное расщепление приводило к образованию фрагмента 691 п.о. с липкими концами Bam HI, который отделялся на 6%-ом полилакриламидномтеле и затем извлекался обычным образом.
Выделенный фрагмент ДНК сшивался с 0,2 мкг обработанной Bam HI и щелочной фосфатэзой плззмидой рВ 322 (фиг.5). По прошествии 16 ч выдержки при 4°С данный материал использовался для трансформации E.coli К12 IA221(NRRLB-15014)a основном согласно процессу трансформации Wensink и др., 1974 г., СМ 3:315-325. Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и плазмиды выделялись обычным образом и идентифицировались путем анализа ограничительного фермента и методом гель электрофореза. Желаемые плазмиды, обозначенные как pNM575 (109 на фиг.5). содержат фрагмент 700 п.о. Bam HI и их обычным образом усиливали (фиг.1) для последующего использования.
С. Построение плазмиды р1101. Кодирующая последовательность зрелого LGH содержала один сайт Fnu .PII, находящийся на расстоянии 47 п.о. от первого нуклеотидатрансляционной инициирующей точки. Примерно 25 мкг плазмиды pNM575 переваривалось в 250 мкл буферного раствора Bam HI с 25 единицами фермента Bam HI при 37°С в течение часа (фиг.6). Фрагмент 691 п,о. Bam HI извлекался обычным образом из 6% полиакриламид- ного геля и очищался. После очистки одна треть этого фрагмента (эквивалентно 8 мкг плазмиды} вываривалась в 100 мкл буферно5 :стлплсс:( лтл гсалтгк ссллсслт ггснк-плсглу пттслсллсссгл п.ассс-.г
I М I I 11 11 11111 11 11 I. I I I I I I I I I I 111 11 11 11 11 i 111111 111111111111
- з1 -тсссл глА/ члтлсстллдс(: ; ггп1Гглл( :г,г;г;лп(:(.:-|(:((: к;1 п:сслтл(:(. ;л1;(н:--.)
, ; Данный фрагмент получается распознавательным фосфотриэфирным способом, 25 посредством которого получены ниже следующие фрагменты: 1) 5 -CTAGAGGGTA-3 ;
2) S -TTACATATGGATTTCC-S1; 3) 5 -CAACCATTCCCCTCTCGAGGC-3 ; 30
4) 5 -TTTTTGACAACG-3
5)5 -CTATGCTCCG3-3 ;
6} S -CGGACCATAGCGTTOS1:
7) 5 -GTCAAAAACCCT-3
8)5 -CGAGAGGGGAAT-3 ; 35
9) 5 -GG-TTGGGAAATO3 ; и
10) 5 -CATATGTAATACCCT-3 .
Используя приготовленные указанные -сегменты, осуществлялись ступенчатым образом реакции катализированного соязыва- 40 нил 14 лигззы, как описано ниже:
а) 5 -нефосфорилированный сегмент 1 смешивался с фосфорилированными сегментами 2, 9 и 10, и подвергался воздействию Т4 лигазы с образованием дуплекса 1 45 ДНК(Вгом/п и др., 1979 г. Методы в энзими- ологии, 63, 109-151). Этот дуплекс извлекался методом препаративного гель электрофореза на 15%-ом полиакриламиде.
б) 5-нефосфорилировзнный сегмент 6 50 смешивался с фосфорилированными сегментами 3, 4, 5, 7 и 8 и подвергался воздействию Т4 ДНК лигазы к образованию Дуплексной формы ДНК 2. Этот дуплекс очищался электрофорезом на 15%-ом поли- 55 акриламлидном геле.
с) ДНК дуплексы 1 и 2 затем соединялись вместе посредством Т4 лигазы, обра- . зуя ДНК дуплекс 1100 (фиг.6), который
го раствора Fnu DII (6 ммоль NaCI; 6 мМоль Трис. .НС1, рН 7,4; 6 мМоль MgCl2: б мМоль /9-меркаптоэтанол) с 2,5 единицами фермента в течение 1,5 ч при 37°С. Электрофорез на 6%-6м полиакриламидном геле и стандартные процедуры извлечения использовались для извлечения фрагмента ДНК 538 п.о., содержащего кодирующую последовательность последних 175 аминокислот LGH, после чего осуществлялась трансляция стоп сигнала.
Двухнитевой фрагмент ДНК (1100 на фиг.6) синтезировали фосфотриэфирным способом, соединяя зону промотора 1рр с кодирующей зоной LGH. Этот двухнитевой фрагмент ДНК (1100 на фиг.6) имел указанную ниже последовательность:
очищался электрофорезом на 10% -ом полиакриламидном геле. Этот ДНК дуплекс ла тем ферментно фосфорилировался с использованием Т4 полинуклеотид киь-тлы и )-32 Р-АТР посредством указанно 1 ниже процедуры.
Экспрессируемая плазмида р1 101 строилась путем сшивки 0,1 пикомоля (0,4 мкг) фрагмента Xbal-Bam HI плазмиды рКЕ N021 (.107 на фиг.4), 0,025 пикомолей синтезированного фрагмента ДНК ( 1100 на фиг.6) и 0,3 пикомоля (0,08 мкг) фрагмента .538 вр плазмиды pN M575 в 24 мкл буферного раствора сшивки с использованием Т4 ДНК лигазы, После инкубации в течение 16 ч при 4°С смесь использовалась для трансформации E.coli A221 (NRR LB-15014). Трансформанты отбирались.на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивировались, ис- пользуясь в качестве предпочтительного источника желаемой выраженной плазмиды р1101.
Д. Построение плазмиды р1103.
Последовательность гена LGH в плазми- де р1101 содержала сайтХ1 -1, начинающийся на 24 основания ниже трансляционной инициирующей точки и сайт Xba HI в некодирующей зоне 5. Примерно 25 мкг плазмиды р1101 вываривались в 250 мкл буферного раствора Bam HI с 25 единицами Xbal и 25 единицами Xhol при 37°С s течение часа. Большой фрагмент, который имел слегка более быстрый пробег, чем линейная плазмида, очищался от агарозного геля, как описано в примере 2А.
Двухнитевой ДНК фрагмент синтезировался фосфотриэфирным способом с вводом короткой открытой рамки считки (цистрон) в переднюю часть кодиЗ -СТЛСЛОбСТЛ ТЛЛТААКГГЛТЛТТСЛТТТТЛ-ЛТЛЛСП.ЛППЛЛТАЛТСЛТЛТССЛТ П СССЛIIHMIIIIillllllllllllHIIIIIIIIIMIimillllMIIIIIIIIM
. 3 -ТСССЛТЛЛТТЛТТЛСЛТЛТЛЛСТЛЛЛЛТТАТТПЛЧХТТЛ i ГЛПТЛТЛССТЛЛЛПССТ- ЛССАТТССССТС-З
Hllillillll
.TGGTAAGCGGACA(;cf-5 .
Данный фрагмент получался методом распознавательного фосфотриэфира, посредством которого получались следующие сегменты:
1) У- СТЛОЛССОТЛТТМТМТСГАТАТТСАТ1ТГААТЛАОСЛО-3
2) 5 -СЛЛТАЛТСЛТЛТООАТГГСССАЛССА 1ТССССТС-3 ; aS OC/GAGGGGMIGOTGGCM
4)5 -A lTAAAATCAATATACAlTA ITAATACCCT-3
Используя приготовленные, какуказано выше, сегменты, осуществлялись катализи- рованные Т4 лигазой реакции соединения путем смешивания 5 -нефосфорилирован- ных сегментов 1 иЗсБ -фосфорилйрованны- ми сегментами 2 и 4 и воздействия на данную смесь Т4 лигазы. Полученный дуплекс затем очищался путем электрофореза на 10% полиакриламидном гоеле. Этот ДНК дуплекс затем ферментно фосфорилировал- ся с использованием Т4 полинуклеатидоки- назы, и путем следующей процедуры. Экспрессируемая плазмиДа hGH р1103 строилась путем сшивки 0,1пико- моля (0,4 мкг) фрагмента Xbal-Xhol плазми- ды р1101 с 0,025 пикомолями синтезированного ДНК фрагмента в 24 мкл буферногоо раствора сшивки с использованием Т4 ДНК лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 4°С эта смесь использовалась для трансформации E.coli IA221 (NRRL В-15014. Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивировались, как предпочтительный источник желаемой выраженной плазмиды р1103(фиг.7).
Е. Построение E.coli K12 RN308/pL 110А.
Плазмида pL110 описана о примерах HI публикации Европейского патента № 0217529, рассматриваемой здесь как ссылочный материал. Рестрикционная и функциональная карта плазмиды р1110 представлены на фиг.8.
Примерно 1 мкг плазмиды ДНК вываривалось с ферментом Ndel в общем объеме 20 мкл. содержащем 2 мкл высокосолевого буферного раствора 10Х (1,0 модь
рующей последовательности LGH, Этот двухнитевой ДНК фрагмент имел указанную ниже последовательность:
5
0
5
0
5
0
5
0
5
NaCI, 0.50 моль Трис-HCI, рН 7,5, 0,10 моль MgCl2 и 10 мМоль flHTHOfpnHTo) единицами фермента Ndel в течение часа при 37°С. Реакционная г.месь экстрагировалась смесью фенол/хлороформ и ДНК осаждалась этанолом. Вываренная с Ndel плазмида pL110 ДНК растворялась в 50 мкл буферного раствора Кленова IX (40 мМоль КР04, рН 7, 5, 6,6 мМоль MgCI; 1,0 мМоль 2-меркаптоэтанол, 33 мкмоль dATp, 33 мкМоль dCTP; 33 мкМо/fb dGTP и 33 мкМоль ТТР). Дава микролитра (10 единиц Mew England Biolabs) крупного фрагмента ДНК полимеразы 1 E.coli, известного как фрагмент Кленова, вводили в данную ДНК и смешивали с ней, полученная реакционная смесь инкубировалась при 16°С в течение часа. Данная реакция завершалась путем экстракции фенолом и ДНК очищалась обычным образом.
Вываренная с Nde 1 и обработанная фрагментом Кленова ДНК затем сшивалась с Т4 ДНК лигазой при 4°С в течение 16 ч.. Полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом RV308 штамма E.coli K12 (NRRL-15624). Трансформанты отбирались на L-агаровых ппастинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и плазмиды отделялись от полученных колоний путем быстрой .щелочной экстракции, описанной Birnboin и Doly. Была отобрана плазмида ph110A (на фиг.8) с отсутствием точки ddel,
F. Построение фага рМЮ.В путем сайт- специфическогоо мутагенеза.
Процедура удаления сайта Bam HI в гене тетрациклин резистентной путем сайт- специфическогоо мутагенеза показана на фиг.8.
F. (i) Построение фага М13ТсЗ.
Плазмида pl..110 служила в качестве источника гена тетрациклин-резестентной. Примерно 50.МКГ плазмиды в 500 мкл буферного раствора ТЕ вводили в 25 мкл буферного раствора 10Х Hind III и 170 мкл воды. Примерно 5 мкл ( 50 единиц) фермента Hind Ml вводили в раствор ДНК плаз- миды phHO и образующуюся реакционную
смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Примерно 13 мкл 2 моль Трис. HCI, рН 7,4, и 5 мкл ( 50 единиц) ограничительного фермента EcoRI вводили в вываренную с Hind ill ДНК плазмиды , данная реакцией- 5 мая смесь инкубировалась в течение более 2 ч при 37°С. Реакция прекращалась путем экстрагирования реакционной смеси фенолом, насыщенным ТЕ; фенол удалялся путем экстракции хлороформом. Вываренная с 10 EcoRI-Hind 111 ДНК плазмиды рН110 затем извлекалась путем осаждения и центрифугирования, вводилась в 1%-й агарозный
гель, выделялось и подвергалось очистке
большое количество ограничительного 15 фрагмента 4,3 KB EcoRI-Hind П.
Примерно 5 мкг фага m/3mp18 (New England Biolabs) растворялось в 50 Мкл буферного раствора ТЕ, затем вываривалось с Hind III и EcoRI, как описано выше. Образо- 20 ванная Hind lll-EcoRI ДНК фага М13 тр18 очищалась, как описано для pL110. с той разницей, что был выделен и подвергнут очистке фрагмент 7,25 кб.
Примерно 100 нанограммов фрагмента 25 4,3 кб плазмиды phi 10 смешивались в примерно 100 нанограммами фрагмента 7,25 кб Hind lil-EcoRI фага М13. mpl18, 2 мкл буферного раствора лигазы-ЮХ, 1 мкл (100 единиц) Т4 ДНК лигазы и 14 мкл Н20. Эта 30 реакционная смесь сшивки инкубировалась при 15°С в течение 1,5 ч, сшитая ДНК заключала в себе желаемую ДНК фага 13ТсЗ. Ре- стрикционнэя и функциональная карта фага 13ТсЗ представлены на фиг.8.35
Один миллилитр ночной культуры E.coii К12 IM1Q9 (E.coii K12 IM101, полученная из New England Biolabs, могла быть использована вместо E.coli K12 IJV1109) использовали для инокуляции 50 мл питательного бульо- 40 на, полученная в результате культура инкубировалась при 37°С с аэрацией до тех пор, пока ODeoo не достигала значения от 0,3 до 0,4. Клетки повторно суспензировались в 25 мл 10 мМоль NaCI, инкубировались на льду 45 в течение 10 мин и собирались путем центрифугирования. Эти клетки снова суспензировались в 1,25 мл 75 мМоль CaClz; 200 мкл аликвоту этих клеток удаляли, вводили в 10 мкл сшитой ДНК, приготовленной как указа- 50 но выше, и инкубировали на льду в течение примерно 40 мин. Смесь клетки-ДНК затем инкубировалась при 42°С в течение 2 мин, а различные аликвоты (1, 10 и 100 мкл) удалялись и вводились в 3 мл верхнего агара (L 55 питательный бульон с 0,5% агаром, поддерживаемом в расплавленном состоянии при 45°С), который также содержал 50 мкл 2% X-Gal 50 мкл 100 мМоль IPTG и 200 мкл E.coii К12, IM109 в логарифмической фазе роста.
Смесь клетки -верхний агар затем помещалась на пластины с агаром, содержащим 40 мкг/мл X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-/ - D-тиогалактозид) и 0,1 мМоль IPTG (изопро- пил-уЗ-О-тиогалактозид), а эти пластины инкубировались при 37°С в течение ночи.
На следующее утро несколько прозрачных в отличие от колоний индивидуально использовались для инокуляции 2 мл питательного бульона L, полученные в результате культуры инкубировались при 37°С с аэрацией в течение 2 ч. Отсутствие синего цвета говорит о том, что произошла желаемая вставка ДНК, Затем данные культуры центрифугировавались, и 200 мкл полученного поверхностного слоя вводили в 10 мл культуры (ООко 0,5) Е. coii K12 IM109, выращенной при 37°С с аэрацией. Эти культуры инкубировались еще в течение 30 мин при 37°С; затем клетки гранулировались путем центрифугирования и использовались для получения репликэтивной формы ре- комбинантного фага, который они содержали. Двухниточная репликативная форма ДНК фага была выделена из клеток с использованием процедуры,описанной в примере 1 в уменьшенном масштабе. Трансформанты, содержащие ДНК фага m 13ТсЗ, были идентифицированы путем рестрикционного анализа фаговой ДНК.
F. (и) Получение однонитевой ДНК фага m 13ТсЗ. .
Полтора миллилитра ночной культуры E.coii K12 IM109/m 13ТсЗ подвергали центрифугированию, 100 мкл поверхностного слоя, содержащего фаг m 13ТсЗ, использо- валось для инокуляции 25 мл культуры E.coii М109 I при ООббО примерно 0,4-0,5. Культура инокулировалась в течение 6 ч при 37°С с аэрированием, в течение этого времени культуру центрифугировали и полученный поверхностный слой (примерно 20 мл) переносили в новую трубку. Примерно 2 мл раствора,содержащего 20% полиэтиленгликоля (PEG) 6000 и 14,6% NaCI, вводили в этот поверхностный слой центрифугирования, который затем инкубировали на льду в течение 20 мин.
Этот поверхностный слой центрифугировали D течение 25 мин при скорости вращения центрифуги 700 об/мин, и полученная гранула, которая содержала од- нониточную ДНК фага ггИЗТсЗ, снова сус- пензировалась в 500 мкл буферного раствора ТЕ.
Раствор ДНК двукратно экстрагировали насыщенным ТЕ фенолом и двукратно экстрагировали хлороформом. Затем осаждалась однониточная ДНК с использованием NaOAc и этанола и подвергалась центрифугированию. Полученная гранула промывалась 70% этанолом, высушивалась и затем растворялась в 60 мкл НаО.
F. (Ill) Мутагенез.
Фрагмент однонитевой ДНК, использу- емый D мутагенезе, был синтезирован в автоматическом синтезаторе ДНК, Этот фрагмент имел указанную последовательность
5 -CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3
и был гомологичен зоне, окружающей точку Bam HI (5 -GGATCO3 ) в придающем стойкость к тетрациклину гене от плазмиды pBR 322 с той разницей, что группа А вторая от конца 5 (или третья от конца 3) представляет собой С в плазмиде p8R 322. Такая замена не изменяет аминокислотный состав придающего стойкость к тетрациклину белка, но устраняет точку Bam HI.
Примерно 10 ликомолей мутагенной за- травки и универсальной затравки 13 (Bethesda Research Laboratories (BRL) P.O. Bex 6009, Gaithersburg, MD 20760) обрабатывались отдельно 10 единицами (BRL T4 полинуклеотидокиназы в 20 мкл буферного раствора киназы IX (60 мМоль Трис. HCI, рН 7,8; 15 ммоль 2-меркаптоэтанола;
10 мМоль MgCla; 0,41 м Кмоль АТР в течение 30 мин мри 370d Обработанная ки- нэзой ДНК использовалась в операции му- тагенеза, описанной ниже,
Отжиг осуществлялся путем перемешивания друг с другом 300 нанограммов (1,2 мкл) однонитевого фага 13ТсЗ, 1 пикомоля (2 мкл}универСальной затравки, 1 пикомоля (2 мкл) мутагенной затравки. 2 мкл 10Х бу- ферногоо раствора (100 мМоль Трис. -HCI, :рН 7,5; 1 мМоль ЕДТА; 500 мМоль NaCI) и 12,8 мкл Н20. Реакционная смесь инкубиро- валась при 80°С в течение 2 мин, при 50 С в течение 5 мин и затем охлаждалась до комнатной температуры.
. Реакция удлинения цепи осуществлялась путем ввода 5 мкл экстенсивного бу- ферного раствора 10Х(500мМольТрис. HCI, рН 8; 1 мМоль ЕДТА и 120 мМоль MgCte), 5 .мкл 2 мМоль, АТР; 1 мкл 6 мМоль раствора в каждом из dGTP ТТР и ЬСТР 1 мкл (2 ед, Pharmacia P.L Blochemlcals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, N.J. 08854) фермента Кленова; 1мкл (100 ед.) Т4 ДНК лигазы; 17 мкл НаО в смесь аналелированиой ДНК, Реакционная смесь вытягивания цепи инкубировалась при комнатной температуре в течение 1 ч, затем при 37°С в течение 2,5 ч и затем в течение ночи при 4°С.
Реакция прекращалась посредством двух экстракций насыщенным ТЕ фенолом, за которы ми следовали две экстракции
. ДНК осаждалась этанолом и NaOAc. ДНК извлекалась Путем центрифугирования и повторно суспензировалась в 50 мкл Н20, 6 мкл буферного раствора 10 XSI затем вводили в этот раствор ДНК.
Раствор ДНК был распределен поровну в три трубки. В две из этих трубок вводили примерно 200 единиц (Miles Laboratories SI) нуклеазы. Одна реакционная смесь инкубировалась при комнатной температуре в течение 5 мин, другая в течение 10 мин. Реакции прекращались путем экстракции реакционной смеси двукратно насыщенным ТЕ фенолом. За фенольным экстракциями следовали две экстракции хлороформом; затем ДНК осаждалась из реакционной смеси NaOAc и этанолом. Не подвергнутый обработке образец ДНК служил в качестве негативного контрольного образца.
Обработанные SI образцы хранились отдельно друг от друга в ходе остальной части процедуры, но результаты получались аналогичные.
Гранулы ДНК повторно суспензировг- лись в 20 мкл НаО, 10 мкл полученного раствора использовалось для трансформации E.coli K12 IM109 (E.coll K13 IM101 также можно было использовать) согласно процедуре, используемой при построении фага m13To3 стой разницей, что ни IpTG ниХ-Gal не подавали на пластины.
Двухнитевая репликативная форма ДНК была выделена примерно из 48 колоний как описано выше и отобрана на присутствие ограничительной точки Bam HI. Маоляты без точки были отобраны путем получения однониточной ДНК, как описано выше, Однониточная ДНК была построена в форме последовательности с использованием метода построения дидеоксипоследова- тельности (I.H.Smith,; 1980 г., Методы в энзимологии, 65:560-580). Желаемый изо- лятбыл обозначен pL110B (фиг.8).
G, Построение плазмиды pL110C.
Примерно 50 мкг репликативной формы ДНК фага pL110B вываривались в 250 мкл буферного раствора IX Nde (50 мМоль NaCI; 6 мМольТрис. HCI, рН 7,5; 6 мМоль MgCla и 6 мМоль /3-меркэптоэтанол), содержащего 50 единиц фермента Ndel при 37°С в течение 2 ч. 5 мкл, 5 мМоль NaCI затем вводили в обработанную Ndel ДНК фага pL110B, после чего вводили 5 мкл (50 единиц) фермента Sal. Вываривание продолжалось в течение 2 ч при 37°С. Желаемый фрагмент 422 Ndel-Sall, содержащий мутантную тет- рациклин-резистентности гена, затем был выделен из акриламидного геля.
ДНК плазмиды pL110A затем вываривалась с Ndel и Sail в аналогичных условиях,
отличающихся тем, что фаг рШОВ был заменен плазмидом . Ограничительный фрагмент б,1 кб Ndel-Sall плазмиды pL110A был очищен от агарозы.
Желаемая плаэмида pL110C была по- 5 строена путем сшивки друг с другом 100 нанограммов каждого из фрагментов Ndel- Sall плазмиды рШОА (б,1 кб) и pL110B 422 п.о.) с использованием обычной процедуры. Желаемая плазмида 110С придает 10 устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина в E.coli, но не имеет сайта Bam HI тетрацик- линрезистентности гена.
Н. Построение п лазмиды p CZRIII.
Плазмида pCZRIII была построена пу- 15 тем сшивки фрагмента 3,5 кб EcoRI-Pstl плазмиды (содержащей не повреж- дек-ную кодирующую последовательность) с фрагментом 3 KB EcoRI Pstl плазмиды Р1ТТ60. Плазмида Р1Т160 содержала фраг- 20 мент - 3 кб EcoRI-Psti. образованный от плазмиды pL110C, вставленной в обработанную EcoRI-Pstl плазмиду PVC18 (New England Biolabs). Этот фрагмент- 3 кб содержал ген тетрациклинрезистентности 25 плазмиды pLl 10C с той разницей, что сайт Clal быУ1 исключен. Рестрикционная и функ- циональная карта р1Т160 представлены на фиг.9. Плазмида р1Т160 могла быть образована от E.coli K12 IM109 (р1Т160, имеющей- 30 ся в лаборатории NRRL, где она хранится под номером NRRL B-18135) в основном согласно процедуре, описанной в примере 1. Плазмида р1Т160 придает устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина и в ней отсутствует 35 сайт рестрикции. Clal. Тетрациклин рези- стентности плазмиды очищался на фрагменте Pstl-EcoRI для использования в построении плазмиды pCZRIII.
Примерно 50 мкг ДНК плазмиды 40 пример 2G) инкубировались в общем объема 250 мкл IX EcoRI буферного раствора, содержащего 10 мкл (50 единиц) EcoRI, в ечение 2 ч при 37°С. Затем вводился 1 мкл Б единиц) рестрикционного фермента, и 45 инкубация продолжалась при 37°С. Аликво- ы удалялись примерно каждые 5 мин и эксрагировались электрофоретически на гарозном геле. Желаемый фрагмент 3,5 кб EcoRi-Pstl содержал неподвергнутый 50 воздействию ген в GH и включал внутренний айт Pstl (на нарезаемый в ходе частичного вываривания с Pstl). Желаемый фрагмент
5 -TATGACTTCCAAGGTTCCCGTCTTTCGTCTAGACGACCTCAACAGCGGC.AAGGTCCTCACCGAGCT-S
шшмшшпшшшмшишшшшшпишшш ,
S -ACTGAAGGTTCCAAnGGCAGAA/.GCAGATCTGCTGGAGTTCTCGCCGTTCCAGGAGTGGC-S
отделялся от нежелаемых фрагментов: фрагмента 2,5 кб Pstl-Pstl, который содержал лишь часть гена в GH, фрагмента 3 кб EcoRi-Pstl, который содержал ген тетрацик- линрезистности; и фрагмента 6,5 кб EcoRI (невываренный Pstl). Фрагмент 3,5 кб Pstl-EcoRI очищался и сшивался с фрагментом 3 кб Pstl-EcoRI плазмиды р1Т160. Сшитая ДНК использовалась для трансформации E.coli K12; IM109, и желаемая плазмида, обозначенная pCZRIII и показанная на фиг. 10, выделялась из трансформанта и характеризовалась с помощью общепринятых методик. Плазмида pCZRIII также могла быть получена из лаборатории NRRL, где она хранится под номером NRR LB-18249.
Плазмида pCZR336 является вектором экспрессии, построенным на основе Xbal- Bam HI фрагмента плазмиды PCZRIII (пример 2Н) и двухцистронной структуры GH от плазмиды р1103 (пример 2Д и фиг.7). Примерно 50 мкг плазмиды р1103 инкубировалось в 250 мкл высокосолевого буферного раствора IX, содержащего 5Dединиц каждого из ферментов Bam III и Xbal о течение 2 ч при 37°С. Фрагмент 650 п.о. Xbal-Bam HI, содержлщий первый цистрон, и ген, кодирующий последовательность GH, отделялся и очищался от акриламидного геля. Примерно 50 мкг плазмиды pCZRIII (пример 2Н) также вываривалось с ферментами Xbal и Bam HI и большой фрагмент Xbal-Bam HI очищался от агарозы. Два фрагмента Xbal- Bam HI сшивались вместе друг с другом, и сшитая ДНК использовалась для трансформации E.coli K12 RV308 (NRR LH-15624) с использованием общепринятых процедур. Желаемая плазмида PCZR336(фиг. 1 идентифицировалась среди трансформантов путем отделения плазмиды и последующего рестрикционного анализа.
I. Построение плазмиды р1104
Плазмида pCZR 336 представляет собой вектор экспрессии, который использует промотор Арп. Для соединения DACS/DAOCS с промоторомЯр1 в плазмиде pCZR 336, необходимо использовать синтезированное связующее звено ДНК. Зто связующее звено соединяло сайт Nde плаэмиды pCZR 336 с сайтом Sstl в кодиру-. ющей последовательности DACS/DAOCS и имело приведенную ниже структуру:
Эта связующая молекула была синтезирована в автоматическом синтезаторе ДНК а виде двух одиночных нитей с использованием общепринятых процедур. Эта связующая молекула имеет несколько отличий от естественной t последовательности Cephalosporium, ни одно из которых не оказывает нежелательногоо влияния на белок, кодированный получаемой последовательностью, Эти изменения включают: 1) образование сайта Ndel, включающего трансляционную инициирующую точку; 2) замену С на А в третьем положении кодона 10, который составляет лейциновый кодон, поскольку СТС и СТА эквивалентны, образуя сайт ХЬа и 3) замену С на Т в третьем положении четвертого кодона, который составляет алиновый кодон, поскольку GTC и СТТ эквивалентны.
Для облегчения последующего клони- рования связующая молекула клонировалась о плазмиду p(JC19 (New Elgland Biolabs).
. Примерно 5 мкг плазмиды pUC19 растворялись в 50 мкл буферного раствора IX SslI (50 мМоль NaCI; 50 мМольТрис. НС, рН -7.5; 10 мМоль MgCl2), содержащего 10 единиц фермента Sstl (BRL). Данная реакционная смесь инкубировалась в течение 2 ч при 37°С. Концентрация NaCI в реакционной смеси затем увеличивалась до 150 мМоль путем добавления 1 мкл 5 мол. NaCI. Вводили примерно 2 мкл (10 единиц) фермента Ndel и смесь- инкубировалась в течение еще 2 ч при 37°С. Затем осаждалась ДНК и извлекалась путем центрифугирования.
Примерно 100 нанограммов вываренной в Sst -Mdei плазмиды риС19 смешивалось с 1 пикомолем синтезированного связующего в буферном растворе лигазы с Т4 ДНК лигазой. Сшитая ДНК использовалась дня трансформации клеток E.coli K12 IM109, и аликвоты этой смеси высевали на чашки на 1-агзре (питательный бульон Lc 15 г на литр агара), с содержанием 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 40 мкг/мл I PTG.
Эти чашки инкубировались при 37°С в течение ночи. Колонии, содержащие плазмиду без вставки, такие как E.coli K12 IM109/pUC19, проявляли синий цвет на этих чашках. Колонии, которые содержали плазмиду с вставкой, такие как E.coli K12 М109/р1104, были белыми. Отбиралось несколько белых колоний и осуществлялся их отбор методом рестрикционногоо анализа их плазмидной ДНК на присутствие фермента 60 bp Ndel Sstl с той же последова1- тельностыо, что и синтезированный, как
указано выше, фрагмент. Типичный изолят желаемого построения обозначен как плаз- мида р1104 (фиг.12).
К. Окончательное построение плазмиды
р1Т507
Плазмида р1Т507 была построена путем сшивки содержащего кодирующего после- довательностьОАСЗ/ОАОСЗ фрагмента Ssil-Bam III плазмиды р1Т508 с вставкой
0 Ndel-Ssil плазмиды р1104 и с расщепленным Ndel-Bam HI фрагментом плазмиды pCZR 336. Фрагмент 2,2 кб Sstl-Bam HI плазмиды р1Т503 (пример 1) получен путем полного пываривания с Bam HI и частичного
5 вываривания с Sstl (другой сайт Sstl расположен на 50 п.о. от сайта Bam HI в желаемом фрагменте 2,2 п.о.).
Плазмида р1Т503 в количестве примерно 50 мкг растворялась в 250 мкл буферного
0 раствора IX Sstl, содержащего 50 единиц Bam HI, и реакционная смесь находилась при 37°С в течение 2 ч. Затем вводили один мкл ( 10 единиц фермента Ssti) осуществлялась реакция при 37°С, Аликвоты удалялись
5 каждые 5 мин, охлаждались смесью фенол , осаждалась ДНК и осуш,ествля- лась грануляция путем центрифугирования. Фрагмент 2,2 кб Sstl-Bam HI, содержащий наибольшую часть кодирующей после0 довательности экспандазы/гидроксилазы, выделялся и очищался от 6% акриламидного геля.
Примерно 50 мкг ДНК плазмиды pCZR 336 (пример 21)суспеидировались в 250 мкл
5 высокосолевого буферного раствора, содержащего примерно 50 единиц каждого из ферментов Ndel или Bam HI и смесь находилась при 37°С в течение 2 ч.
Фрагмент 3,8 KB Ndel-Bam HI плазми0 ды pCZR 336, который не имел кодирующей последовательности, затем был выделен из агарозного геля.
Примерно 100 мкг плазмиды р1104(при- мер 21) суспендировалось в 500 мкл буфер5 ного раствора IX Sstl, содержащего примерно 100 единиц фермента Sstl, и эта смесь находилась при 37°С в течение 2 ч. Концентрация NaCI затем увеличивалась от 50 до 150 мМоль путем добавления 10 мкл 5
0 моль NaCI. Вводили примерно 20 мкл (100 единиц) фермента Ndel и смесь инкубировалась дополнительно 2 ч при 37°С. Желаемый фрагмент 60 вр Ndel/Sstl очищался от 15% агарозного геля.
5Примерно 100 нанограммов фрагмента 5,8 кб Ndel-Bam H плазмиды pCZR 336, 100 нанограммов фрагмента 2,2 KB Sstl- Bam HI плазмиды и 50 нанограммов фрагмента - 60 рв Sstl-Ndel плазмиды р1104 сшивались вместе с лигазой Т4 ДНК.
Сшитая ДНК использовалась для трансформации клеток E.coli K12 IM109 с использованием обычной процедуры с той разницей, что клетки выращивались при 30°С, а не при 37°С (для предотвращения транскрипции от Aph). Сшитая ДНК смешивалась с 100 мкл компетентных клеток М109 (промышленно получаемых Stratagene Corp., 3770 Fansy Street. Сан Диаго. Калифорния, 32121), инкубировалась при 4°С в течение часа, затем инкубировалась в течение 1 мин при 42°С и затем разбавпялась 2 мл свежего питательного бульона L и инкубировалась при комнатной температуре (без встряхивания) в течение часа. Аликвоты высевались на чашках с агаром, содержащим тетрациклин, 10 мкг/мл. Чашки инкубировались при 30°С. Трансформанты E.coli К 12 1М109/р1Т507 идентифицировались путём рестрикционного анализа плазмидной ДНК. Рестрикционная и функциональная карта плазмиды представлены на фиг.11.
Примерз. Определение продуцированной E.coli активности DACS/DAOCS.
А. Культура E. IM109/plT507: экспрессирующаяактивности pACS/DAOCS.
Трансформанты E.col.i K12 IM109 (р IT507 (пример 2К) выращивалась при 30°С в течение ночи в 500 мл питательного бульона L(содержащего 10 мкг/мл тетрациклина) в гйроторном инкубаторе, вращающемся со скоростью 250 об:/мин. Клетки разбавлялись (1:10) путем ввода 100 мл ночной куль- туры в 900 мл свежеприготовленной среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, в 2,8 л колбы Fornbach и дополнительно инкубировались в течение часа при 30°С в тех же условиях выращивания. Температура воз- душного встряхивателя затем повышалась до 42°С, инкубация продолжалась дополнительно в течение 6,5 ч. Чувствительный к температуре репрессор с 1857 лямбда pL промотора, установленный таким образом, что обеспечивалась экспрессия DACS/DAOCS на плазмиде , был инактивирован при 42°С и, таким образом, допускал экспрессию DACS/DAOCS. После инкубации клетки собирались путем цент- рифугирования и использовались как пред- почтительный источник продуцирования активности DACS/DAOCS.
В. Иллюстрация активностей экспанда- зы и гидроксилазы в клетках E.coli K12 IM109/plT507, выращенных при 42°С.
Пример 14 г (сырая масса) клеток E.coii К12 IM109/plT507, приготовленных как описано в примере ЗА. повторно суспендирова-
лись в Трис-GEDA буферном растворе {15 мМоль Трис. HCI. рН 7,5; 10% глицерин; 10% этанол: 10 мМоль дитиотрситол; 10 мМоль аскорбат) в общем объеме 20 мл. Клетки разрывались путем пропускания звука при 4°С или ниже тремя 30-секундными импульсами полной мощности. В ходе пропускания звука осуществляли многоократ- ный ввод фенилметилсульфонилфтррида (pMSF) до тех пор, пока окончательная концентрация не становилась равной 2 мМоль. Вводили декоксирибонуклеазу и сульфат магния до тех пор, пока не достигались концентрации соответственно 1 мкг/мл и 2 мМрль. Подвергнутая пропусканию звука суспензия подвергалась центрифугированию со скоростью 40000 Ад в течение 30 мин. Поверхностный слой заключал в себя сырой экстракт фермента DACS/DAOCS.
Этот сырой экстракт обьемом 13 мл вводился в 50 миллитровую колонну ДЕАЕ-Три- закрил. предварительно уравновешенную с 15 мМоль Трис-GEDA, рН 7,5. Колонку промывали 4-мя объемами 15 мМоль буферного раствора Трис-GEDA и затем линейным градиентом от 0,015 мМоль Трис-GEDA до 0,3 мМоль Трис-GEDA. Пятимиллилитровые фракции собирали при скорости потока 15 мл/ч. Фермент элюировался как один основной пик активности.
Активности DAOCS (экспандоза) и DACS (гидроксилаза) элюировались с тем же временем удерживания.
Ферментную активность определяли, осуществляя анализ, основанный на жидкостной хроматографии высокого давления. Катализированная экспандазой реакция осуществлялась в течение 15 мин при 30°С с использованием 0,28 мМоль пенициллина N 60 мМоль а-нетоглутарата (a-KG), 0,06 мМоль сульфата железа (двухвалентного). 0.67 мМоль аскорбата, 1 мМоль дитиотреи- тола, 0,05 мМоль АТР. и 0,000-0.00 ед. фермента в 1 мл 50 мМоль Трис. HCI, рН 7,5. Катализированная гидроксилазой реакция осуществлялась при 36°С в той же среде с деацетоксицефалоспорином С концентрацией 0,05 мМоль вместо пенициллина N.
Ферментные реакции прерывались путем добавления 1 мл этилового спирта. Осажденный продукт отделялся путем центрифугирования при 4000 хд в течение 5 мин. Поверхностный слой, содержащий ферментные продукты реакции, анализировался методом жидкостной хроматографии высокого давления следующим образом. Активность экпланлазы была определена путем измерения образования как DAOC, так и DAC из пенициллина ввиду явной бифункциональности фермента. Активность гидро- ксилазы определялась путем измерения образования DAC из DAOC.
Аликвоты (от 20 до 100 мкл) поверхностных растворов анализировались на DAOC и DAC посредством жидкостной хроматогра- фии высокого давления (HPLC) с использованиемвнешних стандартов. Предпочтительная система ПР1.С включала два компонента: систему регулятора модели 721 модуль данных модели 730, насосы модели 510 EF, водяной артикуляторный процессор образца модели 710В и спектрофотометр лямбдамакс модели 481LC (Waters Anoc., Milfor, М.А.) DAC и DAOC разделялись предпочтительно с помощью колонки с радиально упакованными спрессованными микроБондпзк(0,8 х 10 см) (Waters Assoc.) с подвижной фазой 2% уксусной кислоты; 0,4% метилового спирта,. 6-7% ацетонитрила; 87-92% воды; рН 8. Скорость потока составляла 1,5-2,0
Частичная очистка DAOCS и DACS от 14 г E.coll K12 1М109/р1Т511.
1 милли и наномолей продукта в минуту на миллилитр экстракта.
2 Не определено.
мл/мин, детектирование осуществлялось при 260 нм (цефалоспоринхромор). Результаты анализа были воспроизводимыми с 2% отклонениями при дубликатных анализах
катализированных как экспендазой, так и гидроксилазой, и гидроксилазой реакций. Для анализа экспландазы количественная оценка на DAC (в дополнение к количественной оценке DAOC) корректировалась на пенициллин N виду совместного элюирования. Результаты анализа приведены ниже.
Формула изобретения
Способ экспрессии DACS/DAOCS активности в клетках Escherichla coli, заключающийся в том, что осуществляют трансформацию штамма-реципиента Е. coli К12 mi09 рекомвинантной плазмидной ДНК pIT 507 с последующим отбором клонов, экспрессирующих DACS/DAOCS-ак- тивность.
Hpal
Xbaln „ Pvuff
Hpal Hpal
frexi
I Hpal
350 Ьр НраЛ Erag/nent MuI
46Z6p Atul Fragment Јco/tlLinkers Tf Ligase i Јco#l
466bpЈcoRl Fragment
pt/e.Z
PBR322 Јco/tl HindM
Sa/nffl
Sail
flvt/I
/EcoRl
/ Atkattne /Pftasphatase
Ц MA Llffase
За/ям Sail
tawid 103 (Figure 2} Htnam
MNtictease
BarriHlLinkers TitUNALigase BamHl
J+DHA LLgase
EcoRl ,
™° x&al Јcoxi SamHl
Salt
jlco/tl Pgrtiat .Digestion f51tfuclease
jHindM Linkers . .., Tj.DNA Ligase
. J НМШ
/ Т UNA Ligase ° indSL Гп г
00/77//1
Jfffl
рг/е.З
Plasm id WSfFigureJ} ,Sall BamHI
Alkaline Pnospfiatase
, PKEN021
Sat
Xbal .
Alkaline PffospfjGttase
рЈ/г.4
Ptas/nidfMEiWI rffffin Figure)
rtpal
, Still Linkers DNALigase
SulI a PvuJt
0ffmM Linkers WMALigase
Bam HI
-950 bp Fragment Sail, Bam HIEnds
Satl
Hindm Jppfl
Mal
rtj/j ff yhnr1luu c „„ Xbal FnuDS
-
Synthet Fragmen
Ptesmid (p KEN О 21 . Xbal-Bamh digested
7707 in figure
Mind Ж
PNM702
Pvul
Synthetic Fragment
Ptesmid (p KEN О 21 . Xbal-Bamhl digested
7707 in figure4)
T6DNALigose
IppP
Xbal Xhol
f/7ifUff
PvulL
Pvul BamHI
Sff/f
pue.6
-T
MdeJ
Pvull INdel Z.Kienow J.TqBNA bigase 4. Transform RVJ08
Hindll
;Ba/nHlMJ/npi8 Sail
(TtSMiigase г Tran storm JM109 JJsotate Simile
&
-ikoiffOA j,M /tTtUNAligase tefSSOObaftSjr-feoXI V ZTranstorm JMO JJsotate Single vull Я I strand
T BomHI /-x isal1 fwiTri llsolateLdroe ( « ) J S tin vitro tnutagensis vith
I rc3lchangeC-A) . I 2.TmiKforfnMtO9
Z.5QHI ., /ЫПТг-
isolate Ldrge( SS ) Fragment. /ltovitmawtegeattSHitt Vhel BttmMSatt || rc3lchongeC-A} ----- I Z.TraasformJfftOS
tcoru- 3jsolate Re/niicatin Form
{(8650to)
-Sail
-Hina/ti 1MeI iSati Nhcl I $Bii3.lsolate TcK Gene
---- lapene V jA /f ///да/// .Trc/ stormRV308 ffi
Wo,-°Л,ЛГ/
pLtfOG у ,„вг даЮ40Ь Т
A#I
Nde-1 Xhol Pvul
Pvul BamHL
Sail
3jsolate Re/nii Nhcl
)
-Sail
&/77«/
Seal
EcoRI
Pvu Pstj famm Xb&
Wtic/M
PstI МлаГМ
/1/,/r HLMM/t
NUI Фиг. Ю
HindHL
ball
Фиг 9
PstI МлаГМ
Xbal
Xbal
EcoKI
