Изобретение относится к способам анализа нуклеотидных инсектицидных компонентов биопрепаратов и может быть, использовано для контроля содержания экзотоксина и дополнительно инсектицидного компонента в биопрепаратах, при отборе штаммов - продуцентов микроорганизмов, подборе питательных сред, контроле биосинтеза экзогенных метаболитов, оптимизации параметров биотехнологического процесса получения инсектицидного биопрепарата на всех этапах промышленного производства, контроле его состояния в процессе хранения, при оценке характера воздействия на растения с целью установления его экологической безопасности и научно-исследовательской практике.
Известен способ определения / -экзотоксина в инсектицидных биопрепаратах, включающий в себя осаждение смеси нукле- отидов, растворение осадка с последующим хроматографическим разделением на пластинах в системе растворителей пропанол- вода-аммиак, взятых в соотношении 13:5:2. Элюцию пятен проводят водой с р Н 3-6,6 и измерение оптической плотности при 254 нм или 267 нм.
Недостатками известного способа являются трудоемкость, связанная с использованием хроматографии, высокая абсолютная погрешность вследствие поVI
4 СЛ
si
ю
терь определяемого вещества на поверхности хроматографической пластины, потерь в процессе его выделения из препарата, падение фотометрической точности измерений вследствие значительного вклада в абсолютную величину измеряемой оптической плотности раствора светорассеяния, возникающего от смываемых в кювету частиц силикагеля с пластин Sllufol-254, а также отсутствие представлений по механизму взаимодействия /8-экзотоксина с другим инсектицидным метаболитом, близкой ему природы, в литературе, зависящего от изменения рН среды в процессе ферментации и анализа.
Цель изобретения - повышение точно- сти способа.
Способ заключается в следующем.
Этап I. Операция 1. Навеску препарата (1 г), взвешенную с точностью до 0,001 г растворяют в 20 мл воды или берут 20 мл культуральной жидкости и доводят их рН соляной кислотой до 4,7 ±0,1, затем центрифугируют (6000 об/мин) и отбрасывают твердые остатки.
В надосадочной жидкости остаются /J- экзотоксин (ЭТ-1), инсектицидный метаболит - экзотоксин-2 (ЭТ-2) адениновой природы, близкой ЭТ-1, а также и другие метаболиты.
Операция 2. Проводится отделение ЭТ- 2 от ЭТ-1 путем смещения рН надосадочной жидкости до 7,2 ±0,1 водным раствором аммиака (15%), раствор центрифугируют (6000 об/мин), в осадке - ЭТ-2, в надосадоч- ной жидкости ЭТ-1 и другие метаболиты.
Операция 3, ЭТ-1 в надосадочной жидкости связывают хлористым барием (BaCIa, 20%, 4 мл), центрифугируют (6000 об/мин), в осадке бариевая соль экзотоксина. К осад- ку добавляют 4 мл 0,1 н.раствора серной кислоты, перемешивают и доводят рН раствором аммиака (25%) до 7,2 и центрифугируют (6000 об/мин). В растворе Р -экзотоксин, который доводят 1 н.соляной кислотой до рН 3,6 ±0,1,
Операция 4. ЭТ-2 растворяют (после операции 2) в 20 мл подкисленного HCI96% этиловым спиртом (рН 5,4±0,1), перемешивают, центрифугируют (6000 об/мин), в осадке ЭТ-2, очищенный от примесей,погло- щающих около 280 нм.
Операция 5. ЭТ-2 растворяют в 20 мл дистиллированной воды и соляной кислотой доводят рН до 3,6 ± 0,1.
Этап II. Водные растворы ЭТ-1 и ЭТ-2 в объеме 20 мл и рН 3,6 ± 0,1 используют при спектрофотометрировании. Измерения
проводят в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Операция 1. В кювету вносят 3 мл дистиллированной воды.подкисленной соляной кислотой до рН 3,6 ±0,1, и добавляют 200 мкл ЭТ-1 или ЭТ-2 и перемешивают.
Операция 2. Определяют величину оптической плотности растворов ЭТ-1, ЭТ-2 при 259, 310. 340 нм.
Операция 3. Обработка результатов спектральных измерений проводится по формуле (1)., выведенной на основе графического расчета вклада светорассеяния раствора в спектр его оптической плотности,
Учет величины светорассеяния при А -259 нм (в области максимального поглощения растворов ЭТ-1 и ЭТ-2) проводят путем линейной экстраполяции результатов измерения величины оптической плотности растворов при А 310 и А 340 нм (поглощение ЭТ-1 и ЭТ-2 отсутствует). Для выполнения графического расчета шкала длин волн должна быть равномерной в области 220-340 нм, для чего нм надо перевести в см . Для перевода нм используют известное соотноше10 1 ниеj-(см). Из подобия треугольников
на графике записывают равенство
п 310 п 340 U О - U о
п 259 п 340 U о U о
10
10
10
10
(1)
310 340
где Do ; Do - оптическая плотность фо- тометрируемых растворов при А 310 и А 340 нм;
уАл
Do - рассчетная величина светорассеяния при А 259 нм. После преобразования выражения (1) получаем
Do259 - 3,23 Do310 - 2,23 (2)
Истинное поглощение растворов ЭТ-1 и ЭТ- 2 находят по выражению
D3T-t T-2 D259 - Do259 - D259 - 3,23 Do310 + 2.23ГЛ (3)
где D - измеренное значение оптической плотности фотометрируемых растворов при А 259 нм.
Полученное значение оптической плотности служит основой расчета концентрации по формуле (3) согласно закону Ламберта-Бера
,эт-2 е C-I,
где е-коэффициент молярной экстинкции, е эт-1 - 13,4 103 (л/моль-см); энце
С - концентрация; I - 1 см, или его иной записи ,эт-2 Ј 1см1 С-17 где е 1см - коэффициент поглощения 1% раствора чистого вещества ЭТ-1, равный 194 ±4.
Определение концентрации экзотоксинов производится по формуле
С-ЛЗГ7 (4)
где К - коэффициент;
К М/н В/ЈЙ&А,
где М - количество дистиллированной воды в кювете при измерении ЭТ-1, ЭТ-2;
н - количество вносимого вещества в кювету;
В - объем раствора при измерении; А - коэффициент пропорциональности, получаемый при введении размерности (г/л) для eicM1
СЭТ-1.ЭТ-2 3,125 ОэТ-1,ЭТ-2 (МГ/Г), ДЛЯ
сухого препарата.
СЭТ-1.ЭТ-2 0,781 ОЭТ-1.ЭТ-2 (Г/Л), ДЛЯ
культуральной жидкости.
Примечание . Ј1см1 для ЭТ-2 пока неизвестен и поэтому принят равным ЭТ-1 на том основании, что поглощение света молекулой каждого из двух токсинов осуществляется главным образом адениновым основанием.
Величина Оэт-1 или Оэт-2 не должна превышать 0,8 ед. при А 259 нм.
Пример 1. Расчет ЭТ-1 и ЭТ-2 в сухом биопрепарате. Берут навеску сухого биопрепарата 1 г(Битоксибациллина, Лепидоци- да или Дендробациллина) и проводят операции, указанные в этапах I и II, затем определяют оптическую плотность (ЭТ-1 и ЭТ-2) в точках спектра с длиной волны 259, 310 и 340 нм и осуществляют расчет по формулам (3) и (4).
D759 0,87; Do310 0.09; Do340 0,03; Do259 0,224 - по расчету.
DST 0,646; Сэт 2,018 мг/г (0,2%).
Пример 2. Расчет ЭТ-1 или ЭТ-2 в культуральной жидкости. Берут 20 мл культуральной жидкости при производстве Би- токсибациллина. Лепидоцида или Дендробациллина и проводят операции, указанные в этапах I и II, затем определяют оптическую плотность каждого из двух экзотоксинов в точках спектра с длинами волн 259, 310 и 340 нм.
Проводят расчет по формуле 31:
D259 0,73; Do310 0,06; D0340 0,03; Do259 0,13;
ОэТ-1 или ЭТ-2 0,6;
Сэт-i или эт-2 0,469 г/л.
Вывод. Примеры 1 и 2 иллюстрируют порядок проведения расчётов и величин оптических плотностей при определении концентрации токсинов в энтомоцидных биологических препаратах, один из которых (Битоксибациллин) содержит два токсина, з два других - только ЭТ-2.
П р и м е р 3. Берут по 3 навески каждого из 3-х препаратов по 1 г и определяют ЭТ-1 и ЭТ-2 при различных двух фиксированных рН (6 и 4,7). Пример иллюстрирует повыше- 5 ние точности способа за счет растворения сухого препарата при фиксированном (4,7 ±-0,1) рН среды с одновременным расширением его функциональной возможности - количественного определения ЭТ-2 10 (см.табл,1).
Вывод, Пример 3 показывает повышение точности определения бетаэкзотоксина за счет увеличения растворения и диссоциации комплекса ЭТ-1 и ЭТ-2 при рН 15 4,7 ±0,1.
Определяется количественно второй экзотоксин за счет его разделения с ЭТ-1 и удаления из раствора осаждением в щелочной среде. Этот токсин найден в ряде других 0 препаратов и определен впервые, что иллюстрирует расширение функциональной возможности способа.
Прим ер 4. Берут 15 навесок препарата битоксибациллина по 1 г и растворяют 5 по 5 навесок в каждой из 3-х серий при 3-х различных рН.
В табл. 2 показана зависимость количественных показателей определения содержания ЭТ-1 в пробах битоксибациллин а 0 одной партии от рН среды при его растворении и отделении экзотоксинов друг от друга. Выводы. Пример демонстрирует увеличение точности определения количества ЭТ- 1 за счет более полного его выделения и 5 отделения от ЭТ-2 с помощью использования фиксированных значений концентра- ций водородных ионов при растворении биопрепарата (4,7 ± 0,1) и разделении двух токсинов в их смеси (7,2 ± 0,1). 0Формула изобретения
Способ количественного определения/ - экзотоксина и инсектицидного экзогенного метаболита в энтомоцидных бактериальных препаратах, предусматривающий добавле- 5 ние в раствор препарата кислоты, удаление нерастворимых веществ, осаждение / -экзотоксина хлористым барием, растворение бариевой соли /3-экзотоксина кислотой, определение оптической плотности раствора с 0 последующим расчетом количества определяемых веществ, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа,добавление кислоты в раствор препарата осуществляют до значения рН 4,6-4,8, после 5 удаления нерастворимых веществ рН раствора устанавливают 7,1-7,3, затем разделяют на растворимую фракцию, содержащую ft -экзотоксин, и нерастворимую, содержащую инсектицидный экзогенный метаболит,
хлористый барий вносят в растворимую фракцию, после растворения бариевой соли Р -экзотоксина кислотой рН раствора устанавливают 7,1-7,3, отделяют раствор и доводят его рН до 3,5-3.7. далее в нерастворимую фракцию, содержащую экзогенный метаболит, вносят соляную кислоту до рН 3,5-3,7, затем удаляют
нерастворимые компоненты и в полученный раствор вносят этиловый спирт с рН 5,3-5,5, отделяют образовавшийся осадок, растворяют его в воде при рН 4,6-4,8 и затем уста- 5 навливают рН 3,5-3,7 и оптическую плотность полученных растворов / -экзотоксина и экзогенного метаболита определяют при длинах волн 259, 310 и 340 нм.
10Таблица1
Использование: производство энтомо- патогенных бактериальных препаратов, контроль инсектицидной активности. Сущность изобретения: препарат растворяют в воде, удаляют твердые частицы центрифугированием, в фугат вносят аммиак до рН 7.1- 7,3, раствор центрифугируют, при этом в твердой фракции (осадке) содержится экзогенный метаболит, в жидкой -/ -экзотоксин. В жидкую фракцию вносят хлористый барий для связывания / -экзотоксина, отделяют осадок в виде бариевой соли экзотоксина центрифугированием. К осадку добавляют раствор серной кислоты, затем рН доводят до 7,2 раствором аммиака и центрифугируют, отделяя жидкую фракцию, содержащую -экзотоксин, и вводят в нее соляную кислоту до рН 4,6-4,8.0садок, содержащий экзогенный метаболит, растворяют подкисленным соляной кислотой этиловым спиртом, центрифугируют, отделяют осадок, затем его растворяют и доводят рН раствора до 3,4-3,6. Водные растворы /3-экзотоксина и экзогенного метаболита фотометрируют и определяют оптическую плотность растворов при 259, 310, 340 нм, Затем рассчитывают количества экзотоксина и метаболита. Способ позволяет повысить точность определения содержания компонентов в энтомоцидном препарате. 2 табл.
Таблица 2
| Вычислительное устройство | 1986 |
|
SU1355974A1 |
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
