Штамм культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., используемый для получения гибридомы Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано при получении гибридом.

Цель изобретения - получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофа- гального фидера, повышенной скоростью пролиферации и выходом гибридом.

Штамм Sp EBR-5 получают следующим образом.

Клетки исходной линии Sp 2/0 Ag 14 обрабатывают бромистым этидием (ЕВ) в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 ч..ЕВ добавляют в среду культивирования следующего состава:

ДНЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глю- тамина, меркаптоэтанола и 40 ед/мл гентамицина при 37°С. Затем клетки отмывают от ЕВ и культивируют в течение 48 ч. После этого клетки высевают на 24-луночные платы в концентрации 100 тыс. клеток на лунку и культивируют в стандартных условиях с разными дозами ЕВ. В лунках с ЕВ в концентрации 1 мкг/мл появляются единичные клоны. Один из них выделен и подвергся многошаговой селекции в течение 60 дней с повыше-

00 00 Јь

10

15

20

25

нием дозы ЕВ до 5 мкг/мп. В результате получен штамм клеток EBR-5, обладающий снижением зависимости полученных на основе этой линии гибридом от присутствия макрофагов, повышенной скоростью пролиферации полученных гибридом, а также повышенным выходом гибридом-продуцентов моНАТ. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Р 309 Д и характеризуется следующими признаками.

Морфология. Культура состоит из клеток одного типа округлой формы. Культура имеет суспензионный тип роста.

В клетках линии Sp ER R-5 по сравнению с клетками линии Sp 2/0 Ag 14 появляется 5 новых хромосомных маркеров (Myj-M p. Два из них (Myj-M встречаются в подавляющем числе клеток (92 и 88% клеток соответственно) и представляют собой субметацентри- ческие хромосомы, возникшие в результате робертсоновских транслокаций: tr Мэд(:2), tr М40ПЗ:3). Три других метацентрика (M4,-M,,j) встречаются редко - в 8, 12, 16% клеток. М4, - ицентрическая хромосома, возникшая в результате транслокации хромосомы 4 на хромосому 9 - tr (4:9) (4 А - Е.:9 А) - F.) М4Ј- телоцентрик tr (14:), происхождение телоцентри- ческой хромосомы Мц неясно. Полученные данные позволяют считать, что клетки Sp EBR-5 характеризуются нали- 5 чием специфических маркеров, позволяющих отличать эту линию от исходной клеточной линии Sp 2/0 Ag 14.

Штамм клеток Sp EBR-5 при введении внутрибрюшинно мышам линии Balb/c по 10б клеток на мышь в 0,5 мл Хэнкса через 10 дней развивается в виде опухоли асцитного типа.

Жизнеспособность клеток поддерживается путем пересевов на свежую питательную среду ДНЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 5-10 мМ меркаптоэтанола, 40 ед/мл гектамици- на с добавлением ЕВ в концентрации 50 мкг/мл. Метод снятия клеток - пипетирование, кратность рассева 1:4, посевная доза 5-Ю4 кл/мл, насыщающая плотность 5-10 кл/мл. Время уддоения популяции 24 ч.

Условия культивирования - на флаконах Карреля при 37°С или в пласти30

40

45

50

55

0

5

0

5

5

0

0

5

0

5

ковых флаконах в СО.-термостате при и 5-7% С0г.

Клетки штамма Sp EBR-5 способны расти при 1% сыворотки со временем удвоения популяции 32 ч, насыщающей плотностью 1-2-Ю5 кл/мл.

Криоконсервирование. Клетки замораживают в эмбриональной сыворотке с добавлением 10% ДМЗО в концентрации 10б кл/мл, режим замораживания: 1°С/мин до -196°С. Клетки хранят в жидком азоте. Режим оттаивания: водяная баня +40°С в течение 1 мин. Жизнеспособность клеток после криокон- сервирования 70% при окраске трипа- новым синим. Клетки после отогрева переносят из 1 ампулы в свежую среду на 1 флакон Карреля.

Штамм Sp EBR-5 сохраняет неизменными свои биологические характеристики на протяжении 60-кратного пассирования в присутствии ЕВ в концентрации 5 мкг/мл, а также рекультивирования после размораживания за период времени более 1 года.

Клетки штамма Sp EBR-5 устойчивы кроме ЕВ еще и к колхицину (0,5 мкг/мл) и к актиномицину D (0,074 мкг/мл) в отличие от клеток исходного штамма Sp 2/0 Ag 14.

Использование клеток штамма Sp EBR-5 в качестве клеток-партйеров при гибридизации с лимфоцитами мышей, иммунизированных эритроцитами коровы, иллюстрируется следующим примером.

Пример. Клетки штамма Sp EBR-5 культивируют на флаконах Карреля в течение 48 ч. Посевная доза на флакон 10 клеток/мл. Состав культуральной среды: среды ДНЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 510 мМ меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина, 5 мкг/мл ЕВ.

Для контроля клетки линии миеломы Sp 2/0 Ag 14 культивируют на флаконах Карреля в течение 48 ч. Посевная доза на флакон была 10 клеток/мл. Состав культуральной среды: среда ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ неосновных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина. Клетки обеих исследуемых миелом.гибридиэовали со спленоцитами, выделенными из селе51

зенки иммунизированных мышей (анти- геном для иммунизации являются эритроциты крови крупного рогатого скота) . Гибридизацию проводят посредством обработки клеток PEG. Далее клетки высевали на 96-луночные планшеты. Через 24 ч после обработки PEG добавляли селективную среду. В случае использования клеток линии Sp 2/0 Ag 14 применяют стандартную среду ГАТ, а в случае использования клеток Sp EBR-5 - среду ГАТ с добавлением 1 мкг/мл ЕВ. Когда гибридные клоны достигают плотности 103 - 1, клеток на лунку (плотность определяют визуально), проводят тестирование на наличие AT постановкой реакции гемолиза. За эффективность образования гибридом - продуцентов- монокловальных антител (монАТ) принимают долю (%) гибридом, продуцирующих монАТ от общего числа образовавшихся гибридных клонов.

46

Выход гибридом-продуцентов монАТ, полученных на основе линии Sp 2/0 Ag 14, составляет 4,83% от общего

количества образовавшихся гибридом, а выход гибридом-продуцентов, полученных на клетках штамма Sp EBR-5, составляет в случае культивирования гибридом на макрофагах - 11,76%,

без макрофагов - 10,14%.

Таким образом, эффективность образования гибридом-продуцентов монАТ на основе клеток штамма Sp EBR-5 в 2 раза выше, чем на основе клеток

линии Sp 2/0 Ag 14. Кроме того, гибрид омы, полученные на основе клеток штамма Sp EBR-5, пролиферируют на ранних этапах развития с более высокой скоростью и растут в отсутствии

макрофагов с момента образования.

Формула изобретений 1Лтамм культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) № 309 D, используемый для получения гибридомы.

Изобретение относится к гибри- домной технологии и может быть использовано при получении гибридом. Цель изобретения - получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофагаль- ного фидера, повышенной скоростью пролиферации и выходом гибридом. Штамм получают из клеток Sp 2/0 путем селекции на резистентность к бромистому этицию (ЕВ) в концентрации 5 мкг/мл. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютами- на, меркаптоэтанола и 40 ед/мл гентамицина. Птамм отличается от исходного появлением по крайней мере двух хромосомных маркеров, устойчивостью к ЕВ, а также к 0,5 мкг/мл колхицина, и 0,074 мкг/мл актиномицина Д. Гибридомы, полученные при гибридизации лимфоцитов мышей с клетками заявляемого штамма, растут без добавления макрофагов и выход продуцентов антител вдвое выше, чем при использовании линии-прототипа Sp 2/0 Ag 14, Штамм депонирован под № ВСКК(П)309Д. О $

Редактор Т.Лазоренко

Составитель Г.Игнатьева

Техред М.Дидык Корректор М.Демчик

Заказ 1126

Тираж 376

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное