Способ определения эффективности гемосорбции Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

И

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается за счет того, что в анализируемую пробу добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди, разбавляют плазму, проводят флуориметрическое исследование контрольной и анализируемой пробы, находят показатель соотношения интенсивности флуоресценции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе, взятой после ге- мосорбции, по сравнению с пробой до гемосорбции считают процедуру эффективной. 3 ил.

Изобретение относится к биохимии и медицине, касается определения снижения уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции и может быть использовано при проведении биохимических анализов в лабораторной медицинской практике при определении степени интоксикации после проведения детоксикацион- ной терапии..

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа.

На фиг.1 показаны спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении плазмы крови: перекись водорода : сульфат меди, равном 1:400:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм; на фиг.2 - спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении

плазма крови:перекись водорода:сульфат меди, равном 1:800:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм; на фиг.З - спектры флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до и после гемосорбции при молярном соотношении плазма крови: перекись водорода : сульфат меди, равном 1:3000:5, при длине волны возбуждающего света 330 нм.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор крови у больного до и после гемосорбции и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделяют плазму. Отделенную плазму крови (концентрация 10 М), взятую до и после гемосорбции, помещают в четыре пробирки по ТОО мкл. В первые две пробирки к плазме крови, взятой до и после гемосорбции, добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди при молярном соотношении плазма

00

00

ел

00

о

крови : перекись водорода : соль двухвалентной меди, равном 1:400...3000:5, а во вторые две пробирки с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции (контроль) добавки перекиси водорода и соли двухвалентной меди не производят. Затем все четыре пробирки с пробами плазмы крови ставят на инкубацию в водяную баню при 37°С. После 30-минутной инкубации пробы, включая и контрольные, разбавляют до концентрации белков в плазме крови, равной 10 М, т.е. в 1000 раз, добавляя 100 мл 0,05 М натрий- фосфатного буфера, рН 7. Разбавление пробы позволяет уменьшить объем используемой для анализа плазмы, обеспечивая при этом точное измерение последующей интенсивности флуоресценции, работая с низкой концентрацией плазмы крови (до М). Затем измеряют интенсивность флуоресценции проб на длине волны 390-410 нм при длине волны возбуждающего света 325-335 нм. Оценку снижения уровня эндогенной интоксикации делают,по интенсивности флуоресценции, сравнивая результаты измерения флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции.

В предлагаемом способе определения снижения уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции на этапе отработки оптимальных его параметров было ус- тановлено, что наилучший эффект от использования заявляемого способа регистрировался при добавлении к плазме кро- в,и перекиси водорода и соли двухвалентной меди в молярном соотношении плазма крови : перекись водорода: соль двухвалентной меди, равном 1:400...3000:5 при концентрации пробы плазмы крови ТО М и при измерении интенсивности флуоресценции на длине волны регистрации 390-410 нм, при длине волны возбуждающего света 325- 335 нм. Высший предел концентрации белков в плазме крови ( М) обусловлен их естественной концентрацией, а нижний предел концентрации (10 М) - зоной чувствительности способа.

Избытки перекиси водорода меньше 400-кратного по отношению к белку плазмы в присутствии соли двухвалентной меди и плазмы крови не приводят к эффекту возгорания флуоресценции. А избытки перекиси водорода больше 3000-кратного по отношению к белку плазмы в присутствии соли двухвалентной меди и плазмы крови приводят к денатурации белков плазмы. Возгорание флуоресценции белков плазмы в присутствии перекиси водорода и 5-кратного избытка соли двухвалентной меди на 400 нм (Двоаб.°330 нм) максимально. При избытках соли двухвалентной меди менее 5-кратного эффект возгорания флуоресценции менее значителен (в присутствии перекиси водорода). А при избытках соли двухвалентной меди более, чем 5-кратные в комплексе с перекисью водорода наблюдается деструкция белка.

Измерение флуоресценции на длине волны ниже 390 нм при длине волны возбуж0 дающего света ниже 325 нм ведет к недоста- точной интенсивности свечения, а

измерение флуоресценции на длине волны выше 410 нм при длине волны возбуждающего света 335 нм не приводит к увеличе5 нию интенсивности свечения.

Ввиду того, что интервал длин волн регистрации и возбуждающего света невелик и возможность проведения измерения интенсивности флуоресценции при его гра0 ничных значениях очевидна, авторы лриводят все три примера осуществления способа с наиболее .оптимальными параметрами длины волны регистрации и длины волны возбуждающего света, а именно: дли5 на волны регистрации - 400 нм, а длина волны возбуждающего света - 330 нм.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получе- нием положительного эффекта при

0 использовании всей совокупнфсти существенных признаков изобретения, указанной в его формуле.

П р и м е р 1. Больная С., 53 года, мед. карта № 3276 поступила на стационарное ле5 чение в Гродненскую областную клиническую больницу 24.02.88 г. с диагнозом: Состояние после аппендэктомии. Перитонит. Сепсис.

После клинико-лабораторных исследований б-ной С. с целью детоксикации орга0 низма был проведен сеанс гемосорбции. Снижение уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции у больной определяли путем сравнения значения отношений интенсивности флуоресценции

5 анализируемой и контрольной проб с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции. Для этого у больной до проведения гемосорбции и последнее будет кровь (по 500 мкл). Отделяют плазму центрифугированием при

0 3000 об/мин в течение 15 мин. Отделенную плазму (концентрация М) помещают в четыре пробирки по 100 мкл в каждую. В первые две пробирки с плазмой крови больной (по 100 мкл, концентрация М), пол5 ученной до и после гемосорбции добавляют 5 мкл перекиси водорода, исходная концентрация 7,94 М, что соответствует молярному соотношению плазма крови: перекись водорода : сульфат меди, равному 1:400:5. Во вторые две пробирки с плазмой крови боль51818586 6

ной (по 100 мкл, концентрация М), пол- Аналогичным образом находят эначе- ученной до и после гемосорбции (контроль) ние интенсивности флуоресценции анали- добавкй перекиси водорода и сульфата ме эируемой пробы и контрольной с плазмой дине производят. Затем все четыре пробир крови, взятой у той же больной С. после

ки с пробами плазмы крови ставят на5 проведения гемосорбции. Для анализируе- инкубацию в водяную баню при 37°С. Через мой пробы (кривая 21 фиг.1) это значение 30 мин инкубации ко всем пробам добавля- равно 4,8 отн.ед.. а для контрольной (кривая

ют по 100 мл натрий-сульфатного буфера,1 фиг.1) - 4,2 отн.ед.. Отсюда отношение концентрацией 0.05 М. рН 7. разбавляя та- найденных значений интенсивности флуоким образом пробу в 1000 раз и получая при10 ресценции анализируемой пробы и контэтом концентрацию белков плазмы крови врольной с плазмой крови, взятой у 6-ной С.

ZttЈЈЈЈSSSZ JZZ.- -Р.«...М.ПОР.

плазмы. После разбавления проб прописы-носят значений отношений (4,70-1,14) вают спектры флуоресценции при длине15 3,56) интенсивности флуоресценции амаливолны возбуждающего света 330 нм.зируемой пробы и контрольной с плазмой

Кривой 1 на фиг, 1 показан спектр флу-крови, взятой у больной до и после проведеоресценции контрольной пробы с плазмойния гемосорбции, судят о снижении уровня

крови больного, взятой до гемосорбции, аинтоксикации при проведении гемосорбции.

кривой (-спектр флуоресценции контроль-20 Приме р2. Больной Г., 59 лет, мед.карной пробы с плазмой крови того же больно-та f 6541 поступил на стационарное лечего. взятой после гемосорбции. Кривой 2 нание в Гродненскую областную клиническую

фиг.1 показан спектр флуоресценции анали-больницу 14.04.88 г с диагнозом: Двухстозируемой пробы с плазмой крови больного,ронняя пневмония. Сепсис. Токсическая энвзятой до гемосорбции при молярном соот-25 цефалопатия.

ношении плазма крови : перекись водородаПосле клинико-лабораторных мсследо- : сульфат меди, равном 1:400:5. Кривой 2 -ваний больному Г. с целью детоксикации спектр флуоресценции анализируемой про-организма был проведен сеанс гемосорб- бы с плазмой крови того же больного, взя- ции. Снижение уровня эндогенной интокси- той после гемосорбции при молярном30 кации при проведении гемосорбции у соотношении плазма крови: перекись водо-больного определяли путем сравнения зна- рода : сульфат меди, равном 1:400:5. Какченйй интенсивности флуоресценции аиа- видно из фигуры 1, по сравнению с конт-лизируемой и контрольной проб с плазмой рольными пробами (кривые I H 1 )в пробах,крови, взятой до и после гемосорбции. За- к которым добавляли перекись водорода и35 бор крови осуществляли аналогично, как сульфат меди (кривые 2 и 2 ), наблюдаютописано в примере 1. Полученную плазму увеличение интенсивности флуоресценциипомещают-в четыре пробирки по 100 мкл. В проб. Для определения снижения уровняпервые две пробирки с плазмой крови боль- интоксикации у больной С. при проведениинога Г. (по 100 мкл концентрация М), гемосорбции находят по спектрам флуорес-40 полученной до и после гемосорбции добав- ценции на фиг.1 отношения значений интен-ляют 10 мкл перекиси водорода, исходная сивности флуоресценции (в относительныхконцентрация 7,94 М и 50 мкя сульфата ме- единицах) анализируемой пробы к контроль-ди, исходная концентрация 102 М, что соот- ной, с плазмой крови больной, взятой до иветствует молярному соотношению плазма после проведения гемосорбции, при этом ис-45 крови : перекись водорода : сульфат меди, пользуют длину волны возбуждения 330 нм, аравному 1:800:5. Во вторые две пробирки с регистрацию ведут на максимуме флуоресцен-плазмой крови больного (по 100 мкл концепции - 400 нм. Значение интенсивности флуо-трация ), полученной до и после гемо- ресценции (кривая 21 фиг.1) анализируемойсорбции (контроль), добавки перекиси пробы с плазмой крови больной С., взятой50 водорода и сульфата меди не производят, до гемосорбции, равно 23,5 отн.ед., а значе-Последующую инкубацию и разбавление ние интенсивности флуоресценции (криваяпроб производят аналогично, как описано в 11 фиг.1) контрольной пробы с плазмой кро-примере 1. После разбавления проб пропи- ви той же больной С., взятой также до гемо-сывают спектры их флуоресценции при дли- сорбции, равно 5 отн.ед. Отношение55 не волны возбуждающего света 330 нм. найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы к конт-Кривой 11 на фиг,2 показан спектр флу- рольной, с плазмой крови взятой дооресценции контрольной пробы с плазмой

гемосорбции, равно ЦЈ 4.7. .крови больного Г., взятой до гемосорбции, а

н ч н 5Кривой 1 - спектр флуоресценции контрольной пробы .с плазмой крови того же больного, взятой после гемосорбции. Кривой 21 на фиг.2 показан спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до гемосорбции при молярном соотношении плазма крови : перекись водорода : сульфат меди, равном 1:800:5. Кривой 2 - спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови того же больного, взятой после гемосорбции при молярном соотношении плазма крови : перекись водорода : сульфат меди, равном 1:800:5. Значение интенсивности флуоресценции (кривая 2 фиг.2) анализируемой пробы с плазмой крови больного Г., взятрй до гемосорбции, равно 26,5 отн.ед., а значение интенсивности флуоресценции (кривая 1 фиг.2) контрольной пробы с плазмой крови того же больного Г., взятой также до гемосорбции, равно 6,4 отн.ед. Отношение найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы к контрольной с плазмой крови, взятой до

265 гемосорбции, равно- -т- 4,14.

Аналогичным образом находят значения интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у того же больного Г. после проведения гемосорбции. Для анализируемой пробы (кривая 2 фиг.2) это значение равно 12,5 отн.ед., а для контрольной (кривая, 1 фиг.2) - 6 отн.ед. Отсюда отношение найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больного

12,5

2,08. По

Г. после гемосорбции, равно

разности значений отношений (4,14-2,08 32,06) интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больного до и после проведения гемосорбции судят о снижении уровня, интоксикации при проведении гемосорбции.

ПримерЗ. Больной Б., 60 лет, мед. карта N 5074 поступил на стационарное лечение Гродненской области клинической больницы 22.03.88 г с диагнозом: Ревматизм, акт. II. Септический эндокардит. Аор- тальномитральный порок сердца. Правосторонняя пневмония. Острая почечная недостаточность.

После клинико-лабораторных исследований был проведен сеанс гемосорбции. Снижение уровня эндогенной интоксикации при проведении гемосорбции у больного определяли путем сравнения значений интенсивности флуоресценции анализируе

мой и контрольной проб с плазмой крови, взятой до и после гемосорбции.

Забор крови осуществлялся аналогич- но, как описано в примере 1. Полученную

5 плазму помещают в четы ре пробирки по 100 мкл. В первыд две пробирки с плазмой крови больного Б. (по 100 мкл. концентрация 10 М), полученной до и после гемосорбции, добавляют 38 мкл перекиси водорода, ис10 ходная концентрация 7,94 М и 50 мкл сульфата меди, исходная концентрация 10 М, что соответствует молярному соотношению плазма крови : перекись водорода : сульфат

меди, равному 1:3000:5. Во вторые две про15 бирки с плазмой крови больного(по 100 мкл, .концентрация 10 М), полученной до и после гемосорбции (контроль), добавки перекиси водорода и сульфата меди не производят. Последующие инкубацию и

20 разбавление проб производят аналогично, как описано в примере 1. После разбавления проб прописывают спектры их флуоресценции при длине волны возбуждающего света 330 нм.

25 Кривой 1 на фиг.З показан спектр флуоресценции контрольной пробы с плазмой крови больного, взятой до гемосорбции, а кривой 1й - спектр флуоресценции контрольной пробы с плазмой крови того же

30 больного, взятой после гемосорбции. Кривой 21 на фиг.З показан спектр флуоресценции анализируемой пробы с плазмой крови больного, взятой до гемосорбции при молярном соотношении плазма крови : пере35 кись водорода : сульфат меди, равном

. 1:3000:5. Кривой 2П - спектр флуоресценции

анализируемой пробы с плазмой крови того

же больного, взятой после гемосорбции при

молярном соотношении плазма крови : пе40 рекись водорода : сульфат меди, равном 1:3000:5. Значение интенсивности флуоресценции (кривая 21 фиг.З) анализируемой пробы с плазмой крови больного Б., взятой до гемосорбции, равно 22 отн.ед., а значе45 ние интенсивности флуоресценции (кривая 11 фиг.З) контрольной пробы с плазмой крови того же больного Б., взятой также до гемосорбции, равно 7,5 отн.ед. Отношение найденных значений интенсивности флуо50 ресценции анализируемой пробы к контрольной с плазмой крови, взятой до

22 гемосорбции, равно ург 2,93.

Аналогичным образом находят значе- 55 ния интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой .крови, взятой у того же больного Б, после проведения геморорбции. Для анализируемой пробы (кривая 2 ,фиг.З) это значение равно 18,0 отн.ед.. а для контрольной (кривая l фиг.З) - 6.5 отн.ед., а отсюда отношение найденных значений интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови; взятой у больного Б. после гемосор&ции, равно

18

,77. По разности значений отношений о,о

(2.93-2,77-0,16) интенсивности флуоресценции анализируемой пробы и контрольной с плазмой крови, взятой у больного до и после гемосорбции, судят о снижении уровня интоксикации при проведении гемосорбции.

Существенно, что добавление к плазме крови больного только одного из действующих реагентов - перекиси водорода или сульфата меди -в указанных примерах молярных соотношений, не влияет На интенсивность флуоресценции в первом случае, а во втором - ведет к незначительным изменениям интенсивности флуоресценции, за- трудняя произвести оценку снижения уровня интоксикации при проведении гемосорбции.

Предлагаемый способ позволяет, по сравнению с известным, снизить исходную концентрацию плазмы крови в анализируемой прЬбе до М (в прототипе используется плазма крови с концентрацией 10 М), при этом обеспечивается необходимая и до- статочная для регистрации интенсивность флуоресценции анализируемой пробы при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 325-355 нм на длине волны регистрации 390-410 км, что свидетельствует о повышении чувствительности определения уровня интоксикации более, чем на 2 порядка. Снижение концентрации плазмы крови

U

$0

10

360

500 360

ФИГ 4

в анализируемой пробе позволяет уменьшить количество используемой для анализа плазмы.

Повышение специфичности предлагаемого способа по сравнению с известным достигается за счет использования в качестве добавляемых реагентов к плазме крови перекиси водорода и соли двухвалентной меди с последующим определением уровня интоксикации в относительных единицах по интенсивности флуоресценции на длине волны 390-410 нм при длине волны возбуждающего света 325-335 нм.

«

.Формула изобретения Способ определения эффективности гемосорбции, включающий забор крови до и после проведения гемосорбции, выделение плазмы центрифугированием с последующим спектрофотометрическим исследованием анализируемой и контрольной пробы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, после выделения плазмы в анализируемую пробу добавляют перекись водорода и соль двухвалентной меди при молярном соотношении 1:400-3000:5, разбавляют плазму в 10-1000 раз, проводят флуориметрическое исследование контрольной и анализируемой проб при длине волны 390-410 нм, находят показатель соотношения интенсивности флуоресценции анализируемой и контрольной проб и при динамическом снижении показателя в пробе, взятой после гемосорбции, по сравнению с пробой до гемосорбции считают процедуру эффективной.

УЮ л(н)

20

10

э

20

360

40

360

iSo ЗбсГ ФИГ 2

,500 дН

500

360

500 Л(нм)