Способ получения вирусного антигена для диагностики висны-мэди у овец в серологических реакциях Советский патент 1992 года по МПК A61K39/21 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса висны-мэди для серологической диагностики этой инфекции у овец.

Цель изобретения - повышение активности и выхода целевого продукта с одновременным снижением продолжительности технологического процесса и себестоимости получаемого продукта.

Поставленная цель достигнута тем, что для репродукции штамма 10 ВИЭВ вируса висны-мэди используют первично трипси- низированную культуру клеток сердца и ее субкультуры, собранную на стадии разрушения 70-80% монослоя инфицированную культуральную жидкость подвергают замораживанию-оттаиванию с последующим концентрированием вирусного антигена ПЭГом в присутствии 0,5 М хлористого натрия.

Пример 1. В опыте использовали 10 матрчсов объемом 100 мл с культурой клеток сердца ягненка (СЯ) Культуру заразили штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди в дозе 1 ТЦД 50/мл. Через б дн вследствии цитопатического действия вируса разрушилось 80% клеток монослоя Собранную в этот период инфицированную вирусом культуральную жидкость после 1 (5 матрасов) или 3 (5 матрасов) циклов замораживания оттаивания отцеггрифугировали для осаждения клеточного дабриса при 3000 об/мин в течение 20 мин В осветленную культу 4

ь v4

О 4 1

ральную жидкость добавили 0,5 М хлористого натрия и 15% ПЭГ (М6000). Посредством встряхивания довели хлористый натрий и ПЭГ до полного растворения. Смесь оставили в холодильнике при 4°С на 15ч. Затем ее подвергли центрифугированию при 10000 об/мин в течение 40 мин. Надосадочную жидкость из центрифужных стаканов слили, а осадок ресуспендировали в трис-НС1-бу- ферном растворе (рН 7,3) до 1/60 первоначального объема инфицированной культуральной жидкости. Активность полученных антигенов исследовали в РДП титрованием с серийными разведениями позитивной контрольной антисыворотки к вирусу висны-мэди. 1 итр антигенов, приготовленных из подвергнутых 1 и 3 циклам замораживания-оттаивания инфицированных культуральных жидкостей, составил 1:3 и 1:5 соответственно. Оба антигена давали специфическую реакцию.

Пример2 В опыте использовали 8 матрасов объемом 1,5 л с культурой клеток СЯ. зараженной штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди в дозе 0,8 ТЦД 50/мл. Инфицированную культуральную жидкость собрали на 7-й день после заражения, когда в результате цитоматического действия возбудителя разрушилось около 80% монослоя. Ее подвергли 3 циклам замораживания-оттаивания, центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин, смешали осветленную надосадочную жидкость с 0,5 М хлористого натрия и 10% ПЭГ (М 6000), после чего выдержали при 4°С в течение 15 ч и отцентрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендировали в трис-НСЬбуферном растворе (рН 7,2) до 1 /40 первоначального объема инфицированной культуральной жидкости. Титр полученного антигена в РДП был равен 1:2. Диагностикум не давал неспецифические реакции.

П р и м е р 3. Культуру клеток СЯ в роллерных флаконах объемом 0,2 л заразили 0,9 ТЦД 50/мл штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди. Через 6 дн. после заражения вследствии цитопатического действия вируса разрушилось 70% монослоя роллерных культур. Собранную в этот период инфицированную культуральную жидкость подвергли 3 циклам замораживания-оттаивания, центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин. В осветленной культуральной жидкости растворили 0,5 М хлористого натрия и 12% полиэтиленгликоля. Смесь выдержали при 4°С 18 ч и отцентрифугировали при 1000 об/мин в течение 30 мин. Осадок после удаления из центрифужных стаканов надосадочной жидкости, ресуспендировали

в трис-НС1-буферном растворе (рН 7,4) до 1/50 исходного объема инфицированной культуральной жидкости. Титр полученного антигена в РДП составил 1/5.

Пример 4. Обобщенные результаты 2

серий экспериментов по изготовлению пре- ципитирующего антигена из штамма 10 ВИЭВ вируса висны-мэди на культурах клеток СЯ и тестикулог, эмбрионов овцы (ТЭО)

0 представлены в таблице.

Средняя концентрация преципитино- гена вируса определялась как среднее арифметическое частных от деления преци- питирующей активности всех серий антиге5 на, определенной в РДП, на кратность их концентрирования ПЭГом по сравнению с исходным объемом инфицированной культуральной жидкости. Выражена в преципи- тирующих единицах-ПЕ. 1ПЕ соответствует

0 наибольшему разведению антигена, дающего в РДП с антисывороткой видимую линию преципитации.

Вирусный антиген полученный предложенным способом является высокоактив5 ным. Предложенный способ позволяет значительно сократить продолжительность технологического процесса, поскольку культура клеток СЯ быстро формирует монослой и разрушение его штаммом 10 ВИЭВ вируса

0 висны-мэди происходит приблизительно на 1 нед. быстрее, чем других клеточных систем. Полученный антиген имеет более низкую себестоимость за счет доступности и низкой стоимости сырья для изготовления

5 культуры клеток СЯ, а также возможности проведения многократного (в наших опытах до 25-30 пассажей) субкультивирования этой культуры клеток.

Предложенный способ найдет примене0 ние и лабораториях и на биопредприятиях при получении вирусного антигена для диагностики висны-мэди у овец в серологических реакциях.

Формула изобретения

5Способ получения вирусного антигена

для диагностики висны-мэди у овец в серологических реакцияхг включающий приготовление первично трипсинизированной культуры клеток и ее субкультур, зараже0 нме их штаммом 10 8ИЭВ вируса висны-мэди, сбор инфицированной культуральной жидкости на стадии разрушения 70-80% монослоя с последующим замораживанием-оттаиванием, концентрированием из

5 надосадочной жидкости вирусного антигена ПЭГом, инкубирование при 4°С в течение 10-12 ч, осаждением и ресуспендировани- ем в трис-НС -буферном растворе до 30-60 кратной концентрации от исходного объема, отличающийся тем. что с целью

повышения активности и выхода целевого продукта с одновременным снижением продолжительности технологического процесса и себестоимости получаемого продукта, в качестве первично трипсинизированной культуры клеток используют культуру клеток сердца ягненка, а концентрирование ПЭГом проводят в присутствии 0,5М «юристого натрия.

Использование, вирусология, диагностика Сущность изобретения в качестве производственного штамма использовали изолят 10 ВИЭВ вируса висны-мэди, а в качестве чувствительной к нему культуры клеток - первично-трипсинизиро- ванную культуру клеток сердца ягненка и ее субкультуры. Разработан метод концентрирования вирусного антигена из инфицированной культуральной жидкости 10-15% ПЭГом (М 6000) в присутствии 0,5 М хлористого натрия путем центрифугирования при 10000 об/мин 30-40 мин с последующим ресуспендированием осадка в трис-НС -бу- ферном растворе (рН 7,2-7,4) до 30-60-кратной концентрации от исходного объема инфицированной купьтурэльной жидкости 1 табл. сл с