Питательная среда для получения антигена адгезии 987 @ Р энтеропатогенных ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для выявления антигена адгезии 987Р при диагностике колибактериозов молодняка сельскохозяйственных животных.

Диареи, вызываемые энтеропатогенны- ми LirraMMaM Escherichia coli, играют ведущую роль в заболеваемости молодняка сельскохозяйственных животных. Установлено, что наличие антигенов адгезии на поверхности бактериальной клетки

коррелирует с вирулентностью штамма. Так, гибель животных от диареи, вызываемой штаммами, синтезирующими антиген адгезии 987Р, может достигать 100%. Меры борьбы с заболеванием включают в себя тестирование возбудителя, профилактическое вакцинирование и лечебные мероприятия. В двух первых случаях необходимо выделение антигена 987Р. Однако выражение этого признака подвержено так называемой фазовой вариации. Синтез пилей происходит по принципу все или ничего.

Выращивание возбудителя в лабораторных условиях селективно для беспилевой фазы.

Известно получение колоний для выделения антигена адгезии путем комбинации жидких и твердых сред различного состава. Пробирки с 10 мл BHI (Difco) засевают синтезирующим фимбрии 987Р штаммом в беспилевой фазе, культивируют в статических условиях 18 ч при 37°С и делают высев из верхней части пробирки на твердую питательную среду на основе BHI до изолированных колоний. Крупные прозрачные колонии, выросшие через 18 ч при 37°С вновь высевают в пробирки с жидкой средой и повторяют описанную процедуру 2-3 раза. Через 3 пассажа удается оттестировать несколько колоний, синтезирующих антиген адгезии 987Р. Стабильность синтеза в работе не указана.

Недостатком сочетания жидкой и твердой питательных сред на основе BHI является длительность эксперимента (до 30 сут) и небольшое количество Pirn колоний.

Известно получение колоний штаммов, синтезирующих адгезии 987Р на триптическом соевом агаре (ISA, Difco) с добавлением 1 % а-метилманнозида в атмосфере 5% С02.1

Недостатком этой среды является низкая частота появления Flm колоний и быстрая утрата признака при пересевах.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является мясо-пептонный агар с добавлением 5% крови барана.

Недостатком этой среды является либо отсутствие экспресии антигена, либо быстрая утрата признака, если он есть, при пересевах.

Цель изобретения - стабилизация накопления целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что для выращивания штамма, исследуемого на наличие адгезина, применяют мясо-пептонный агар, дополнительно содержащий бикарбонат натрия, инозит и хлористый калий при следующем содержании компонентов, г:

Ыа2СОз0,1-0,25

Инозит0,05-0,1

KCI0,05-0,1

Мясо-пептонный агарДо 100

Пример 1. Для приготовления среды, содержащей 0,1 г №2СОз, 0,05 г инозита и 0,05 г KCI, стерильно смешивают 1 мл 10%- ного раствора Ыа2СОз, 0,5 мл 10%-ного раствора инозита и 0,5 мл 10%-ного раствора KCI. Затем обьем среды доводят до 100 мл расплавлением мясо-пептохным агаром, перемешивают и разливают в чашки Петри по 20 мл. На приготовленную таким образом среду засевают референс - штамм Escherichia coli 987 (NADC из лаборатории Национального центра болезней животных США. Харгет В.Мун) до изолированных колоний и выращивают 18 ч при 37°С. 50 произвольно выбранныхколоний перекалывают на испытуемую среду, выращивают в тех же условиях и проверяют на наличие адгезина в реакции агглютинации

0 на стекле со специфической анти-987Р-сы- вороткой. Таким образом проведено 10 пассажей. Результаты свидетельствуют о том, что 100% исследуемых колоний сохраняют максимальное выражение признака в тече5 ние 1D пересевов.

Пример 2. Для приготовления среды, содержащей 0,25 г №2СОз, 0,1 г инозита и 0,1 г KCI, стерильно смешивают 2,5 мл 10%- ного раствора №2СОз 1 мл 10%-ного рас0 твораинозита и 1 мл 10%-ного раствора KCI. Затем объем среды доводят расплавленным мясо-пептонным агаром до 100 мл, перемешивают и разливают по 20 мл на чашки Петри. Анализ пилеобразования выполня5 ется аналогично примеру 1. Результаты тестирования пятидесяти колоний анти-987Р-сывороткой показывают, что, используя среду предлагаемого состава, можно добиться 100% экспрессии признака на О протяжении 10 пересевов.

Пример 3. Для приготовления среды, содержащей 0,175 г Ма2СОз, 0,075 г инозита и 0,075 г KCt, стерильно смешивают 1,75 мл 10%-ного раствора №2СОз, 0,75 мл 10%-но5 го раствора инозита и 0,75 мл 10%-ного раствора KCf. Затем обьем среды доводят до 100 мл расплавленным мясо-пептонным агаром, перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают. На

0 приготовленную таким образом среду засевают референс штамм Escherlchia coli 987до изолированных колоний и выращивают 18ч при 37°С. Дальнейшие исследования проводят как описано в примерах 1 и 2. Получен5 ные результаты соответствуют данным, представленным в примерах 1 и 2. Суммирование результатов, приведенных в примерах 1 и 2, а также изложенный свидетельствуют о том, что входящие в со0 став предлагаемой среды инградиенты в интервалах 0,1 -0,25 г (сода), 0,05-0,1 г (инозит), 0,05-0,1 г (калий хлористый) не влияют на рост бактериальных клеток, на выражение антигена 987Р, Увеличение в среде концен5 трации №2СОз и инозита более чем в два раза приводит к подавлению роста исследуемого штамма. Уменьшение их концентраций - к репрессии синтеза антигена 987Р и стабильности его выражения при пересевах.

Отсутствие KCi в питательной среде, также как и присутствие его в более высоких концентрациях (0,2 г), чем указано в предлагаемой среде, не влияет на рост бактериаль- ных клеток, однако его присутствие необходимо для полноценного и стабильного синтеза антигена 987Р.

Пример 4. Выращивание референс- штамма на мясо-пептонном агаре, Мясо- пептонный агар разливают по 20 мл в чашки Петри, подсушивэют и перекалывают на них 50 колоний штамма, находящегося в фазе пилеобразования ( с предлагаемой среды). Затем выращивают колонии 18 ч при 37°С, тестируют анти-987Р-сывороткой и вновь перекалывают на мясо-пептонный агар. Сделано 7 пересевов, результаты свидетельствуют о том, что синтез антигена при пересеве штамма, находящегося в фазе пилеобразования, на мясо-пептонном агаре подвержен значительным колебаниям. Через 7 пересевоа только 10% колоний синтезируют адгезии.

Пример 5 Анализ пилеобразования на мясо-пептонном агаре, содержащем только Ма2СОз Для приготовления среды, содержащей 0 1-0,25 г №2СОз, стерильно смешивают 1-2,5 мл 10%-ного раствора Na2C03 и мясо-пептонный агар до конечного обьема 100 мл Дальнейший анализ проводят соответственно примеру 1. Данные анализа синтеза антигена пятьюдесятью произвольно выбранными колониями рефе- ренс-штамма показывают, что при использовании для выращивания штамма среды, содержащей 0,1-0,25 г №2СОз,синтез антигена подвержен значительным колебаниям (штамм взят в стадии пилеобразования).

Пример 6. Для приготовления среды, содержащей 0,1 г №2СОз и 0,05 г инозита, стерильно смешивают 1 мл 10%-ного раствора Na2COa, 0,5 мл 10%-ного раствора инозита и добавляют расплавленный мясо- пептонный агар до конечного объема 100 мл. Дальнейший анализ проводят в соответствии с примером 1.

Данные анализа синтеза антигена штаммом, находящимся в фазе пилеобразования, показывают, что добавление двух указанных компонентов в мясо-пептонный агар недостаточно для максимального стабильного выражения признака

Пример Сравнительные характеристики питательных сред для выявления адгезии 987Р. Триптический соевый агар (ISA, Difco), агар на сердечно-мозговой вы- тяжке (BHI, Difco), среда Дагестанского НИИ на основе гидролизата кильки готовятся в соответствии с прописями. Для приготовления кровяной среды 95 мл расплавленного мясо-пептонного агара сте- рильно смешивают с 5 мл дважды отмытых эритроцитов барана. Предлагаемая среда готовится как указано в примере 1 Все среды разливают на чашки по 20 мл, высевают на них штрихом референс-штамм Е coli 987, находящийся в беспилевой фазе, и выращивают в течение 18 ч при 37°С. Затем проверяют на наличие антигена и вновь пересевают на ту же среду.

В табл,1 представлены результаты 6 пе- ресевов референс-штамма на различных, средах.

Из табл.1 следует, что предлагаемая среда способствует максимальному стабильному выражению антигена у штамма, находящегося в беспилевой фазе.

Пример 8 Среды готовятся как указано в примере 7. Анализ признака производится так же. С целью изучения стабильности выражения признака референс-штамм засевают в пилевой фазе. Результаты представлены в табл.2. На среде предлагаемого состава пиле- вая фаза сохраняется стабильно.

Таким образом, из приведенных приме- ров следует, что среда предлагаемого состава стимулирует выражение антигена адгезии 987Р, а также способствует поддержанию его максимального количества.

Формула изобретения Питательная среда для получения антигена адгезии 987Р энтеропатогенных Escherichia coli, включающая мясо-пептонный агар, отличающаяся тем, что, с целью стабилизации накопления целевого продукта, она дополнительно содержит бикарбонат натрия, инозит и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, г:

Бикарбонат натрия0,1-0,25

Инозит0,05-0,1

Хлористый калий0,05-0,1

Мясо-пептонный агарДо 100

Таблица 1

Использование: ветеринарная микробиология, антиген адгезии, выявление антигена, питательная среда, состав, диагностика колибактериоза. Сущность изобретения заключается в том, что для выращивания штамма, исследуемого на наличие антигена адгезии 987Р, используют питательную среду, содержащую помимо мясо-пептонного агара 0.1-0,25 бикарбонат натрия, 0,05-0,1 г инозита, 0,05-0,1 г хлористого калия. 2 табл, 2 2 00

Таблица 2